[发明专利]狂犬病毒套式RT－PCR检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种狂犬病毒检测方法，尤其是提供一种狂犬病毒套式RT-PCR检测方法及检测试剂盒，用于动物脑组织样品、唾液样品及脑脊液样品狂犬病毒的检测，属于传染病的诊断试剂盒技术领域。

背景技术：

狂犬病是由RV引起的重要人兽共患自然疫源性传染病，在病毒分类上，RV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)，该属成员划分成7个基因型，我国人畜狂犬病的病原均属基因I型。

和所有的传染性疾病一样，确诊狂犬病只能通过实验室诊断。尽管血清学检测和组织学检测对诊断狂犬病具有一定的意义，不过最终确诊还是要以发现病原为目标，即检测到RV。据世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)推荐，狂犬病病原诊断的标准方法包括直接免疫荧光检测(FAT)、乳鼠脑内接种实验(MIT)，酶联免疫吸附实验(ELISA)以及RT-PCR等方法。其中FAT是狂犬病诊断的“金标准”，但是由于必需要配备荧光显微镜，以及检测样品新鲜程度要求严格，判定结果时对经验的依赖要求高，难以在基层单位推广；市场上已经有了狂犬病的ELISA检测试剂盒，采用该试剂盒检测时，重复性差，成本高，对待检样品要求严格；至于MIT方法不但检测周期长，更是对生物安全有了很高的要求。

在《狂犬病实验室操作手册》(WHO，1996年)中提供了WHO和OIE下属的标准检测机构依据RT-PCR技术进行RV检测的参考方法，这些方法在目的序列选择上各不相同，实际应用表明，这些方法对蝙蝠、猪等动物的脑组织样品检测时出现了较多的非特异性扩增带，并且在检测时间上均无法在12小时以内获得结果，难以满足快速诊断的需要。此外，尽管目前我国RV野外分离株仅限于基因I型，但是考虑到大陆架构的特点，对外贸易和人口流动的实际情况，以及RV易感物种分布的多样性，尚无法排除我国不存在其他基因型RV，因此建立一种快速、灵敏、特异性强，可以针对多种基因型RV检测的方法成为了我国狂犬病防治工作的重要内容。

发明内容：

本发明一种狂犬病毒套式RT-PCR检测方法，克服了现有狂犬病毒检测方法重复性差，成本高等缺点。

本发明还提供了适用于上述检测方法的RT-PCR检测试剂盒，具有检测快速、灵敏、特异性强等特点。

狂犬病毒套式RT-PCR检测方法是：将RT-PCR检测的样品进行预处理后，提取总RNA，并以狂犬病病毒ERA株的细胞培养物作为RT阳性对照样品，未接毒细胞培养物作为阴性对照样品，与待检样品同时进行总RNA的提取操作，并做明确标记；通过套式RT-PCR反应获得特异性扩增产物，将狂犬病毒SRV9细胞毒的总RNA的反转录产物作为PCR阳性对照样品，样品稀释液作为阴性对照样品，与待检样品cDNA同时进行套式PCR操作，并做明确标记；取扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，当RT阳性、PCR阳性对照呈扩增阳性，RT阴性、PCR阴性对照呈扩增阴性时，判定检测反应成立；此时，若检测样品在与阳性扩增带分子量大小一致的位置出现特异性扩增条带，则判定为检测阳性，否则判定为阴性。

具体检测方法步骤如下：

A、样品总RNA的提取

用于RT-PCR检测的样品包括：脑组织样品，细胞培养RV、脑脊液及唾液样品。

(1)组织样品的预处理

以样品稀释液(0.01mol/LPBS(pH7.2-7.4))10×稀释研磨待检脑组织，样品采集部位以小脑、脑干及海马角为宜，避免样品间交叉污染。取100μL研磨液，置1.5mL离心管中，待检。

(2)液体样品的预处理

含细胞培养RV、脑脊液以及唾液。

用棉签采集的唾液样品处理时，将采样棉签倒置于离心管中，加入500μL样品稀释液4℃静置2h，4℃2000～3000r/mim离心10min，取200μL上清，置1.5mL离心管中，待检。

其他液体样品不需预处理，取200μL直接检测。

B、提取总RNA

于1mL总RNA提取液中加入待检样品100μL，室温作用5min后，加入100μL萃取剂，剧烈震荡60s后，室温条件下12000r/min离心10min；取水相上清，加入600μL RNA沉淀液，混匀后4℃静置10min，10000r/min离心10min；弃上清后加入200μL RNA洗液，10000r/min离心5min后弃上清并于室温晾干后加入20μL反转录预混体系。