[发明专利]真空渗透辅助大豆未成熟子叶再生体系的高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种真空渗透辅助大豆未成熟子叶再生体系的高效遗传转化方法，其特征在于：所用的外植体为大豆未成熟子叶。

2.如权利要求1中所述的转化方法，包括如下步骤：

1)大豆未成熟子叶体细胞胚的诱导及增殖：

采用20～40mg/L 2，4-D诱导的方法在暗培养条件下得到大豆未成熟子叶体细胞胚胎，并使其进一步增殖为子叶型胚体，将子叶型胚体转入空培养皿中25℃光照条件下进行干燥培养；

2)真空渗透辅助导入外源DNA：

将干燥处理5-7天的胚体浸入根癌农杆菌液(OD600＝0.5)中，快速抽真空至-23Hg条件下感染5～15分钟；转入1/2MS培养基+蔗糖30g/L+5.5g琼脂粉(pH＝6.5～7.0)中共培养3天；

3)转基因植株的获得：

共培养后的外植体放在1/2MS培养基附加抑菌剂的固体培养基上进行培养，每2周继代一次，当抗性胚体萌发小植株时，转入1/2MS培养基+0.3～0.5mg/L NAA附加相应抗生素的培养基上进行生根培养；当长出发育良好的根茎后进行练苗移栽。

3.如权利要求1中所述的转化方法，包括如下步骤：

(a)取开花后20天左右的大豆幼荚，用75％的酒精表面灭菌；

(b)将子叶去掉胚轴，近轴面向上接种于MS培养基+2，4-D 20mg/L+蔗糖3.0g/L+植物凝胶3.0g/L，pH＝6.0，黑暗条件下培养14-30天；

(c)选取色泽明亮并呈球形的绿色胚状体，移至MS培养基附加2，4-D5.0mg/L+天门冬酰胺1.0g/L+蔗糖3.0g/L+植物凝胶3.0g/L(pH＝5.8)中，25℃光照培养，每两周继代一次；

(d)将体细胞胚转到MS培养基+活性炭4.0g/L+麦芽糖60.0g/L+植物凝胶3.0g/L(pH＝6.4)上，25℃光照培养，每两周继代一次；

(e)将长出的子叶型胚体放入MS培养基+麦芽糖60.0g/L+植物凝胶3.0g/L(pH＝6.4)上，25℃光照培养；

(f)4～6周后，待子叶型胚体颜色转变为奶油色将其转入无菌的空培养皿中25℃光照条件下进行干燥培养；

(g)将干燥处理5-7天的胚体浸入根癌农杆菌液中，快速抽真空至-23Hg条件下感染10分钟；转入1/2MS培养基+蔗糖30g/L+5.5g琼脂粉(pH＝7.0)中共培养3天；

(h)共培养后的外植体放在1/2MS培养基+头孢霉素250mg/L+羧苄青霉素250mg/L+卡那霉素80mg/L+植物凝胶3.0g/L(pH7.0)培养基上进行培养，每2周继代一次，当抗性胚体萌发小植株时，转入1/2MS+NAA0.5mg/L+头孢霉素250mg/L+羧苄青霉素250mg/L+卡那霉素100mg/L+植物凝胶3.0g/L(pH7.0)中进行生根培养；当长出发育良好的根茎后进行练苗移栽。