[发明专利]真空渗透辅助大豆未成熟子叶再生体系的高效遗传转化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及植物基因工程领域，公开一种真空渗透辅助大豆未成熟子叶再生体系的高效遗传转化方法，从而改良大豆遗传性状的操作方法。

背景技术：

大豆的遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一，虽然也有不少成功得到大豆转基因植株的报道，但是大豆遗传转化一直没有突破性的进展。究其原因，最重要的一点就是转化率没有显著提高。

目前应用于大豆遗传转化的方法主要分为两类：1、直接法：主要包括基因枪法、花粉管通道法、电击法、微注射法等；2、载体法：主要包括根癌农杆菌介导法。其中获得广泛应用的只有基因枪法和根癌农杆菌介导法。即使这两种方法在应用中也有一定的局限性。如何真正实现大豆的高效转化仍然是该领域所面临的主要问题。

农杆菌转化法采用的受体材料大多为子叶节，这一系统由Cheng等用无菌苗子叶节首次报道成功再生植株。这个系统相对于其他不定芽和体细胞系统有其一定的优点，但由此系统获得的植株嵌合体多，后期筛选工作量较大。

大豆体细胞胚再生系统首次获得再生植株是由Christianson在1983年报道的。其采用的外植体为胚轴，此后的报道采用的外植体大多为未成熟子叶和完整幼胚。但真正能应用于转化的是Finer等所建立的系统，把未成熟子叶放在含40mg/L 2，4-D的MS培养基上诱导出体胚，胚性组织在继代培养过程中可在诱导培养基或含低水平2，4-D的液体悬浮培养基上增殖。组织学分析表明，新生胚分布在旧胚表面，易于进行转化，而且可在液体培养基中进行筛选，这样由于筛选介质与可增殖胚的高面积接触而使筛选变得高效，从而可以克服嵌合体的问题。此后许多实验室都采用这一系统获得了非嵌合的转基因植株。其中Stewart于1996年报道了其把Bt基因导入大豆并获得了抗虫害的转基因植株。

发明内容：

本发明公开一种真空渗透辅助大豆未成熟子叶再生体系的高效遗传转化方法，的目的在于克服现有大豆遗传转化效率低的难点，采用大豆未成熟子叶作为外植体，在根癌农杆菌介导的方法中提供一种利用真空渗透辅助转化外源DNA的方法。

本发明的具体方法包括以下步骤：

一、大豆未成熟子叶体细胞胚的诱导及增殖：

采用20～40mg/L 2，4-D诱导的方法在暗培养条件下得到大豆未成熟子叶体细胞胚胎，并使其进一步增殖为子叶型胚体，将子叶型胚体转入空培养皿中25℃光照条件下进行干燥培养。

二、真空渗透辅助导入外源DNA：

将干燥处理5-7天的胚体浸入根癌农杆菌液(OD600＝0.5)中，快速抽真空至-23Hg条件下感染5～15分钟。转入1/2MS培养基+蔗糖30g/L+5.5g琼脂粉(pH＝6.5～7.0)中共培养3天。

三、转基因植株的获得：

共培养后的外植体放在1/2MS培养基附加抑菌剂的固体培养基上进行培养，每2周继代一次，当抗性胚体萌发小植株时，转入1/2MS培养基+0.3～0.5mg/L NAA附加相应抗生素的培养基上进行生根培养；当长出发育良好的根茎后进行练苗移栽。

本发明的积极效果在于：采用了真空渗透辅助农杆菌介导的方法，在一定的真空条件下、一定时间处理后，能够在大豆体细胞胚上制造许多微小伤口，充分提高了农杆菌入侵机会，明显提高了农杆菌的感染效率，与普通农杆菌介导法相比，显著提高了大豆的转化率。另外，本发明采用大豆未成熟子叶作为外植体进行遗传转化，避免了采用子叶节作为外植体进行转化时容易产生嵌合体的问题。

附图说明

图1为实施例1转反义PEP基因高油大豆部分植株的RT-PCR；

1：阳性对照质粒；2：阴性对照；3～8：转基因大豆；M：分子量Marker

图2为实施例1转反义PEP基因高油大豆部分植株的Southern blotting检测；

M：分子量Marker；+：质粒；-：阴性对照(未转基因大豆)P1-P3：转反义PEP基因大豆；

图3为实施例2大豆转双价Bt基因植物的PCR分析；

1：分子量Maker；2：质粒DNA；3：：阴性对照；15：非转基因材料；4-14，16-20：转基因材料

图4为实施例2转抗虫基因大豆部分植株的Southern blotting检测(HindIII酶切)；M：分子量Maker；+：阳性质粒；-：阴性对照(未转基因植株)；1-4：转基因植株

具体实施方式