[发明专利]一种微生物转化生产胱氨酸的方法

说明书

【技术领域】本发明属于氨基酸的生产技术领域，涉及通过微生物催化法底物前体得到的半胱氨酸，进一步氧化生产胱氨酸的方法。

【背景技术】L-半胱氨酸和L-胱氨酸是含硫的基本氨基酸，由于其分子中含有活性的巯基，具有许多重要的生理功能，如可以增强肝功能、解除苯中毒、化痰、促进毛发生长和防止食品氧化等，广泛地用于医药、食品添加剂以及化妆品等领域。

L-半胱氨酸是非发酵法生产的氨基酸，不能像谷氨酸那样用常用的碳、氮源和其他营养物质通过微生物发酵来生产；同时，由于L-半胱氨酸的巯基活性强，化学合成步骤繁多，其产品为DL型外消旋体，拆分后才能得到L-半胱氨酸，因此很难化学合成。传统的生产方法一直沿用抽提法，即将毛发用酸(或碱)加热水解、中和、脱色、过滤、结晶获得胱氨酸，再经电解后得到L-半胱氨酸。毛发中胱氨酸，含量约为14％，国外目前毛发水解法的最高收率为9至10％，国内约为4.5至5.5％。用毛发酸解制取L-半胱氨酸，收率低，能耗高，水解过程产生难闻气体及大量废酸，环境污染严重；化学合成法制取L-半胱氨酸合成步骤繁多，两种方法均有弊端。由于微生物的培养和酶的分离技术成熟，微生物酶法转化所需要的底物来源易得、工艺简单，对环境污染的程度低。随着L-半胱氨酸用途的开拓，世界需求量年年增长，用微生物酶法转化生产L-半胱氨酸越来越引起人们的重视。因此，用微生物酶法转化合成氨基酸和某些药物将是具有广泛应用前景的新工艺路线。

1978年Sano用嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌(Pseudomonas thiazolinophilum)AJ3854菌株产生的胞内酶，酶法水解DL-2-氨基-Δ²噻唑啉-4羧酸(DL-2-Amino-Δ²thiazoline-4-CarboxylicAcid，ATC)制取L-半胱氨酸获得成功，从40g/L ATC得到31.4g/L L-半胱氨酸，转化率为78.5％。

2002年日本的Toshikazu和Shiba报道了假单胞菌BS菌株由DL-ATC经酶法转化生成L-半胱氨酸的关键基因。它是通过L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中C₂-S单键，以N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)为转化的中间产物，再经N-氨甲酰-L-半胱氨酸氨甲酰水解酶催化生成L-半胱氨酸，称为N-代途径(L-NCC途径)图1(B途径)。

1997年韩国Ryu报道了以DL-ATC为底物，微生物酶法转化生成L-半胱氨酸的固定化工艺，推测此转化途径涉及三种酶，不同于N-代途径，可能为“S-代途径”。

不论由发酵法、酶催化法、合成法或其它任何方法得到的含半胱氨酸反应液，由于反应液的组成化合物复杂，并且半胱氨酸在水中的溶解度极高，在其半胱氨酸分离过程中，一般是先将最初得到的半胱氨酸进行分离和提纯，然后与强酸如盐酸或对甲苯磺酸反应而生成相应的盐。这些方法一般流程都复杂，得到的半胱氨酸产率低。所以要从复杂的发酵液中，分离出高纯度的半胱氨酸是困难的。但由于半胱氨酸相当容易氧化成胱氨酸，利用这一特性，可以先将反应液中的半胱氨酸转化成胱氨酸，使其沉淀析出，然后再将分离出的胱氨酸电解还原成半胱氨酸，从而得到纯的半胱氨酸。

【发明内容】本发明目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种在以恶臭假单胞菌TS-1138全细胞为酶源，酶法催化DL-ATC合成L-半胱氨酸，并在氧化剂的存在下氧化水溶液中的半胱氨酸成胱氨酸的方法。

本发明自行分离获得一株恶臭假单胞菌TS-1138菌株(Pseudomonas putida TS-1138)，通过相关酶的分离纯化等初步研究表明，该菌株以S-氨甲酰-L-半胱氨酸为中间产物(L-SCC)，由S-代途径(L-SCC途径)酶法合成L-半胱氨酸。合成路线见图1(A途径)。

其中所述的恶臭假单胞菌TS1138(Pseudomonas putida TS-1138)，已于2007年1月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.1920。