[发明专利]色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵工程领域，涉及一种氨基酸合成代谢途径加强的基因工程菌。

背景技术

L-色氨酸(tryptophan)，又名β-吲哚-α-氨基丙酸，属于芳香族氨基酸。L-色氨酸在人和动物的生长发育、新陈代谢中起重要作用。目前，L-色氨酸作为原料广泛应用于加工配制饲料、保健食品、配方膳、氨基酸片剂和氨基酸注射液等。

L-色氨酸最早生产时主要依赖于蛋白质水解和化学合成，以后又出现了发酵法和酶法生产工艺，但是，上述方法存在着工艺繁琐、成本高或产量不能满足大规模工业化生产需求等问题，使国际氨基酸市场上L-色氨酸价格长期居高不下。随着基因工程技术方法的产生和发展，为构建高产氨基酸基因工程菌提供了新的机遇，尤其是近年来第三代基因工程技术(即代谢途径工程技术)的出现更进一步推动了氨基酸基因工程菌研究的发展。1979年，前苏联首先成功地利用体外构建重组质粒的基因工程方法选育了高产苏氨酸生产菌，满足了工业化生产苏氨酸的要求，开创了氨基酸发酵工业的新纪元。自上世纪80年代中期以来，用体外重组技术的方法构建氨基酸生产菌株的研究在国外广泛开展，并取得了不少进展。目前，国内尚没有采用第三代基因工程技术研究选育色氨酸基因工程菌的专利申请。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒。

本发明的第二个目的是提供一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌。

本发明的第四个目的是提供一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒，用下述方法制成：采用pET22b(+)单质粒多基因串联表达的策略，将色氨酸合成酶基因trpBA与磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体M3serA基因串联，得重组质粒pET-T7 promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7 terminator，命名为M3BAT-I。

一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，用下述方法获得：以λDE3噬菌体侵染宿主菌Escherichisa coli 491，使溶源化后的命名为DE3-491的细菌的染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7 RNA聚合酶基因，将一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒M3BAT-I转入感受态DE3-491后，成为一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，命名为M3BAT-I+DE3-491。

一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，用下述方法获得：(1)选取tnaA基因上下游侧翼序列片段与卡那霉素抗性基因kan^r，连接构建串联基因盒pET22b-tnaA5′-kan^r-tnaA3′，并将线性化片段tnaA5′-kan^r-tnaA3′通过Red同源重组系统替换掉命名为M3BAT-I+DE3-491的一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌染色体上的tnaA基因，导致该基因正常功能的丧失，得到色氨酸酶缺陷株，命名为M3BAT-I+DE3-491ΔT。

一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌的应用，包括下述步骤：将命名为M3BAT-I+DE3-491ΔT的敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌按质量百分含量为3％-7％比例加入M63培养基中，37℃培养至OD₆₀₀达到1.0后，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养，培养50-54小时。

一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，以IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，M3BAT-I在DE3-491可表达44kD、37kD、29kD蛋白(图2)，分别相当于色氨酸合成酶β亚基、磷酸甘油酸脱氢酶M3突变体、色氨酸合成酶α亚基。酶活性分析表明，色氨酸合成酶的活性分别比含空载体的对照菌株提高了3倍左右，磷酸甘油酸脱氢酶总活性提高了约4倍。一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌培养后，培养上清液色氨酸含量由原来的2mg/L提高到99mg/L。

附图说明

图1为本发明一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒(M3BAT-I)构建流程图。