[发明专利]一种分离和固定化酶的免疫磁性微球的制备方法及其应用

说明书

【技术领域】本发明属于生物技术领域，涉及利用免疫磁性微球进行酶的分离纯化和固定化的方法，特别是可用于分离纯化L-半胱氨酸脱巯基酶的免疫磁性微球的制备及其在合成L-半胱氨酸中的应用，以提高L-半胱氨酸的转化率。

【背景技术】传统方法上，酶的分离纯化过程较为繁琐复杂，需经过细胞破碎、离心分离、盐析、疏水层析、阴阳离子交换层析和凝胶过滤层析等过程，导致酶的收率较低。

酶的固定化技术已成为生物技术中非常活跃的研究领域之一，传统上主要是采用吸附、包埋、交联以及共价结合等方法，均具有各自的局限性，开发新型、高效的固定化酶技术已成为这一领域的发展趋势。

磁性微球(Magnetic Microspheres，MMS)，或叫磁性微珠(Magnetic Beads，MB)是近年发展起来并广泛应用于磁性材料、生物工程以及生物医药等领域的一种新型多功能试剂。磁性微球是指含有磁性金属或金属氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)超细粉末而具有磁响应性的高分子微球。由于其超顺磁性，给目标生物产品的分离带来了革命性的发展；而且由于其在磁性环境可以快速富集，因此为实现免疫学分析分离以及靶向给药提供了可能。由于磁性微球具备成本低廉，材质优良以及生物相容性高等诸多优点，其应用范围已日渐广泛。

免疫磁性分离(Immunomagnetic separation，IMS)，是基于磁性微球发展起来的一项新技术，通过将抗体固定于磁性微球载体上，实现对目标抗原的一步分离纯化，在具有高效的磁响应性能的同时，又具有亲和层析的高度特异性。早期用于抗体固定化的方法主要采用物理吸附法和化学耦联法，前者结合效率低且存在抗体泄漏的问题，后者借助于化学官能团耦联抗体，存在随机性，并因空间位阻的存在而降低其抗原的结合活性，这无疑影响了免疫磁性分离技术的应用研究。

【发明内容】本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，为酶的分离纯化和固定化技术开辟一条新的途径，涉及利用免疫磁性微球对目的酶进行一步分离纯化和固定化的技术。

本发明采用金黄色葡萄球菌蛋白A(ProteinA)作为桥联剂将IgG抗体固定于磁性微球载体上，以生物特异性耦联法代替了传统的物理吸附法和化学键合法，所制备的免疫磁性微球可应用于一步分离纯化目的酶，以及进一步固定化目的酶，进而对其底物进行连续的催化反应。

本发明具体内容包括：

一.免疫磁性微球的制备：

制备用于分离纯化和固定化酶的免疫磁性微球，是将按照中国专利ZL03144274.9所述方法活化后的磁性微球与ProteinA溶液于4℃反应过夜，采用PBS缓冲液充分洗涤6～8次；再将耦联有Protein A的磁性微球置于NaHCO₃-NaCO₃缓冲液中与多抗血清或者单抗腹水进行吸附连接；经PBS充分洗净后，采用二甲基庚二酸酯(DMP)进行ProteinA和IgG与磁性微球表面的交联固定，最后加入TBS缓冲液终止反应，充分洗净后即得到可用于目的酶的分离纯化的免疫磁性微球，其抗体耦联量为4～10mg/mL。

二.目的酶的分离纯化：

将耦联有抗目的酶抗体的免疫磁性微球与含有目的酶的细胞裂解液混合，于2～8℃振荡反应2～12小时；然后将其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，弃去反应液，经PBS充分洗净后，采用甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 1.5～3.5)于2～8℃振荡解离吸附的目的酶；磁性分离微球，并采用PB缓冲液中和解离液，即得到纯化的目的酶。所收集的免疫磁性微球经PBS洗净后，可重复使用。

三.目的酶的固定化：

将耦联有抗目的酶抗体的免疫磁性微球，与细胞裂解液混合，并于2～8℃振荡反应2～12小时；然后将其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，除去反应液，经PBS充分洗净后，结合有目的酶的免疫磁性微球可用于催化特定的底物进行连续的酶促反应。

与传统上分离纯化酶的方法相比较，采用生物特异性耦联法制备的免疫磁性微球用于目的酶的分离纯化和固定化，具有方便、新颖、高效等优点。

本发明的有益效果：本发明采用生物特异性耦联的方法，将单克隆或多克隆抗体固定于磁性微球载体上，得到可用于分离纯化和固定化酶的免疫磁性微球；通过免疫磁性微球，无须对样品进行复杂的前处理，可以直接从细胞裂解液中，一步分离纯化和固定化目的酶，大大简化操作步骤。该免疫磁性微球可多次重复使用，提高了效率降低了成本。本发明不同与传统方法，为一种简便、快速、高效的酶分离纯化和固定化的新技术。

【附图说明】