[发明专利]一种构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法及其用途

权利要求书

1、一种构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法，所述的β-防御素2用MBD2表示，包括以下步骤：

1)用脂多糖LPS刺激哺乳动物的皮肤，获得表达MBD2的皮肤组织；

2)采用RT-PCR方法从步骤1)中获得的皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片断，用overlap PCR法将小鼠Igκ信号肽与MBD2成熟片断相连，构建MBD2分泌表达载体pMBD2；

3)采用脂质体法将空载体及pMBD2分别转染L1210细胞，获得稳定表达细胞系，构建了MBD2肿瘤疫苗。

2、根据权利要求1所述的构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤2)包括：

1)引物设计及合成：设计β-防御素2成熟部分上游和下游引物，并在下游引物中引入MluI酶切位点；def1:5’GAACTTGACCACTGCCACACC3’，def2:5’CCGACGCGTTCATTTCATGTACTTGCAAC3’；在成熟序列前拼接Igκ信号肽所需上游引物：IgK：5’ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAACTTGACCACTGC3’，在引物中引入Xho I酶切位点；pIRES载体Neo基因表达检测引物neo1：5’GGTGGAGAGGCTATTCGGCT3’；neo2：5’GATAGAAGGCGATGCGCTGC3’；

2)RT-PCR扩增分泌性MBD2基因片段：Trizol试剂盒提取小鼠皮肤细胞总RNA，M-MLV逆转录酶逆转录合成cDNA，用def1、def2引物扩增MBD2成熟部分基因片段，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃×1min，55℃×1min，72℃×40S，30个循环后，72℃延伸10min，扩增片段长度129bp，上述扩增产物为模板，以Igκ及MBD2成熟序列下游引物def 2为引物，Overlap PCR扩增分泌性MBD2基因片段，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃×1min，55℃×1min，72℃×40S，30个循环后，72℃延伸10min。扩增片段长度195bp；

3)PCR产物克隆和MBD2重组质粒的构建：回收纯化分泌性MBD2 PCR产物，产物和pIRES质粒用XhoI和Mlu I双酶切，胶回收后用T₄DNA连接酶体外重组。

3、根据权利要求1所述的构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤1)为用10ng/ml LPS涂抹于DBA/2小鼠背部皮肤表面，作用4小时后处死小鼠，剪下处理过的皮肤，冻于液氮；取RNA前从液氮中取出皮肤组织，在研钵中加液氮研磨碾碎，收集细胞。

4、权利要求1构建β-防御素2肿瘤疫苗在制备白血病免疫药物中的应用。