[发明专利]一种酶法制备15NL－苯丙氨酸的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种酶法制备¹⁵NL-苯丙氨酸的方法。属食品、医药、化工领域。

背景技术：

¹⁵NL-苯丙氨酸是L-苯丙氨酸中的¹⁴N元素被同位素¹⁵N所取代的稳定性标记化合物，无放射性，使用不受时间限制，与放射性氨基酸相比，安全、方便，尤其适于婴幼儿，是一种优良的示踪剂。由于L-苯丙氨酸是人体所必须的氨基酸之一，作为合成蛋白质的基元，可合成具有重要生物活性的酶、激素等。因此，采用¹⁵NL-苯丙氨酸作为示踪剂，利用氨基酸的代谢，对揭开生物体内和细胞内的理化过程，了解生物体的新陈代谢起到了关键性作用。

Mosoni等^[20]报道[U-¹⁴C]苯丙氨酸标记于小麦胞壁木质素上，研究胞壁降解中木质素的代谢。反刍动物草料消化过程中酚类转化较小，可能转化只针对某种官能团，用[U-¹⁴C]苯丙氨酸标记木质素，可示踪此微量转化，评价反刍发酵中酚类转化的程度及确定转化机理。Curtius^[21]于1972年首次应用环上氘标记苯丙氨酸为示踪剂，采用GC-MS分析技术建立了测定人体苯丙氨酸-4-羟化酶活力的方法，并对苯丙酮尿症病人进行负荷试验，测定了该酶活力，该酶活力可反应肝病的严重程度，对肝病的诊断治疗有一定意义。

标记苯丙氨酸的制备国外研究较多。LeMaster D.M.et al.通过Escherichia coli.发酵，用标记的DL-[1-¹³C]lactate生物合成L-[3，4-¹³C₂]phenyl-[1-¹³C]alanine；Halldin C.et al.用苯丙氨酸转氨酶法将标记的phenyl-[3-¹¹C]苯丙酮酸和¹¹CO₂转氨生成L-phenyl-[3-¹¹C]alanine；Tanimura K.et al.通过Pd/C催化还原反应将cyclo[(Z)-Δphe-D-Ala]和²H₂合成D-phenyl-[2，3-²H₂]alanine；Fujihara H.et al.用N-acetyl-DL-苯丙氨酸和²H₂O合成L-phenyl-[2-²H]alanine，收率高达97％。苯丙氨酸解氨酶法标记L-苯丙氨酸国外也有报道。戴腾昌等用²H-苯丙氨酸示踪和GC-MS分析技术测定人体内苯丙氨酸-4-羟化酶活力，用于肝病的诊断及治疗。

迄今为止，¹⁵NL-苯丙氨酸的制备，国内外唯一相关的报道是用苯丙氨酸解氨酶法合成[2-¹³C，¹⁵N]L-苯丙氨酸。Hadener A.和Tamm Ch.用[2-¹³C]肉桂酸和¹⁵NH₄Cl合成L-phenyl-[2-¹³C，¹⁵N]alanine，纯度62.9％，收率29％，87.8％，¹⁵NH₄Cl得到回收。此研究标记的苯丙氨酸纯度与收率均低，标记氮源¹⁵NH₄Cl用量高，氮源回收装置(Parnas-Wagner)复杂，操作不易控制。因此，改进¹⁵NL-苯丙氨酸的制备工艺，提高标记产品的纯度、收率和丰度，有效回收标记氮源，对标记氨基酸的扩大生产有非常重要的意义。

其它可借鉴的普通苯丙氨酸的制备方法中，提取法不能引进同位素；化学合成法获得的DL-苯丙氨酸需拆分，步骤繁琐，副产物多，分离复杂，收率低。发酵法氮源多而复杂，不易得到，制备周期长，产量低。且由于氮源多而复杂，影响产品丰度。

发明内容：

本发明的目的是提供一种酶法制备¹⁵NL-苯丙氨酸的方法。通过苯丙氨酸解氨酶酶促转化¹⁵N-硫酸铵与反式肉桂酸生成¹⁵NL-苯丙氨酸，在简化工艺，提高¹⁵NL-苯丙氨酸的产量、纯度和同位素丰度的同时有效回收标记氮源。