[发明专利]呼吸道合胞病毒亚单位疫苗、制备方法和应用

权利要求书

1、呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，含有截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G。

2、根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，其特征在于还含有无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素LT佐剂。

3、根据权利要求1所述呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，其特征在于截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aa130～230之间的氨基酸，并且将aa182～186之间的氨基酸CAWIC(CX3C模序)替换为RSVM蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成G_CTL蛋白，其氨基酸序列为：

MTVKTKNTTTTQIQPSKSTTKQRQNKPQNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTYLEKESIYYKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTIKTTKKDPKPQTTKPKEVPTTKPHHHHHH

其对应的基因序列为：

ATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATACAACCTAGCAAGTCCACCACAAAACAACGTCAAAACAAACCACAAAACAAACCTAATAATGATTTTCACTTTGAAGTGTTCAACTTTGTACCATGCAGCATCTGCAGCAACAATCCAACTTACCTGGAAAAAGAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCAACAAAAAAACCAACTATCAAGACAACCAAAAAAGATCCTAAACCTCAAACCACAAAACCAAAGGAAGTACCTACCACCAAGCCTCACCACCACCACCACCACTAA。

4、根据权利要求1～3任一所述的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗是将G_CTL蛋白基因重组到细菌表达载体上，并在大肠杆菌中表达、制备。

5、权利要求1～3任一所述的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，由下述方法构建而成：

1)以全基因合成截短的RSV G蛋白基因序列nt288～690总共303bp，以及引物gc1：5′-CTTTCTTTTTCCAGGTAAGTTGGATTGTTGCTGCAGATGC-3′；gc2：5′-GAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3′；gp1：5′-GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC-3′；gp10：5′-GCGGATCC TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3′；其中，gp1、gp10用于扩增G蛋白基因，并引入Nde I和BamH I酶切位点和6×HIS标签，gc1，gc2用来突变G基因中的CX3C模序，替换为CTL表位；引物gp1、gp10进行PCR扩增，PCR产物即为截短的G基因；以G基因为模板，分别用引物gp1/gc1以及gc2/gp10进行扩增，获得片段g11和g210，这两个片段纯化后适量混和为模板，再用引物gp1/gp10进行扩增，获得突变的G_CTL基因；

(2)重组表达载体G_CTL/pET22b的构建：G基因和G_CTL基因纯化后分别用Nde I和BamH I于37℃酶切2小时，回收纯化片段，与纯化的表达载体pET22b双酶切产物用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物通过热休克法转化用CaCl₂制备的E.coli DH5α，涂布Amp⁺-LB平板，37℃培养16小时，挑取数个单菌落接种Amp⁺-LB培养液，37℃振荡培养12小时，碱裂解法抽提质粒，Nde I和BamH I双酶切质粒，构建重组质粒采用上述方法再次转化E.coli BL21(DE3)用于诱导表达G_CTL蛋白。