[发明专利]呼吸道合胞病毒亚单位疫苗、制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法，更具体地说是应用大肠杆菌表达重组呼吸道合胞病毒G蛋白及突变G蛋白，并与无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素制备疫苗，用于人体或动物预防接种，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，属于生物技术领域。

背景技术：

人类呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial virus，RSV)是全世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原体，免疫缺陷病人及老年人也是RSV的易感人群。仅在美国估计每年因RSV感染住院的就有90000个婴幼儿，其中死亡率为2％～5％。我国不但有RSV散发性感染，还发生过数次大规模爆发流行。小儿呼吸道感染的患者中，合胞病毒的感染率达到12.3％，其中小于7月龄的患儿的合胞病毒感染率高达67.10％，2岁时儿童约有90％以上感染RSV，住院治疗约占0.5％～2％。

正如其它病毒引起的疾病一样，至今没有特异性治疗方法。本病对小儿健康危害很大，临床表现以低热、下呼吸道感染病变多见，婴幼儿多呈阵咳、憋喘症状，甚至死亡。只有采用特异抗体进行被动免疫治疗，但给患儿和家长带来极大的痛苦和财产损失。所以疫苗的研究显得非常迫切，世界卫生组织(WHO)早已将RSV疫苗列为全球疫苗发展计划中优先发展的疫苗之一。

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，简称RSV)属于副粘病毒科，肺病毒属，中等大小(200～300nm)，有囊膜，为单股负链RNA病毒。基因组由约15000个核苷酸组成，编码3种跨膜蛋白(F、G、SH)，2种基质蛋白(M1、M2)，3种核衣壳蛋白(N、P、L)和2种非结构蛋白(NS1、NS2)。RSV囊膜上的膜融合(F)和粘附(G)糖蛋白可以诱导RSV中和抗体，是病毒疫苗研究开发的重要蛋白。F蛋白与G、SH蛋白共同参与病毒外膜与宿主细胞膜胞的融合以及细胞培养过程中胞合体的形成，F蛋白可引起体液免疫和细胞免疫；G蛋白介导与宿主细胞膜的粘附，在RSV中主要参与决定抗原的多样性，因此将RSV可分为A、B亚型，他们之间的G蛋白仅有53％的氨基酸同源性，在我国主要流行A亚型。

在对呼吸道合胞病毒疫苗的研究和开发方面，公知的RSV疫苗有灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗。60年代使用RSV灭活疫苗免疫儿童时可以诱导中和抗体的产生，但不具保护性，而且疫苗使用后增强了幼儿后继感染野毒株RSV的发病程度，住院治疗和死亡率显著提高。

而RSV的减毒活疫苗给予1～2月龄未感染过RSV的婴儿时，会导致上呼吸道的轻微至中度充血，表明还需要进一步减毒。虽然减毒活疫苗的临床试验没有引起疫苗增强疾病，但减毒活疫苗仍存在免疫原性差、毒力令人难以接受和遗传不稳定性，人们对使用该疫苗仍有疑虑。

亚单位疫苗被认为是使用很安全的，不存在减毒活疫苗的毒力返祖和免疫原性差等问题，没有RSV灭活疫苗使用后病情加重的担忧。国外现已有RSV膜糖蛋白G和F为主构建的两种蛋白亚单位疫苗完成了II期临床试验。临床试验结果表明，PFP和BBG2Na疫苗是安全的，耐受性好并具有免疫原性。以F蛋白为主的PFP疫苗是由细胞培养RSV，病毒经裂解纯化F蛋白制成的亚单位疫苗，因此生产成本高，病毒大量培养时有安全风险；而由细菌表达的以G蛋白为主的BBG2Na疫苗，虽然降低了生产成本、提高了生产的安全性，但是由于G蛋白以及RSV的其它膜蛋白本身是糖蛋白，细菌表达系统没有糖基化功能，因而影响了疫苗的抗原性，降低了免疫效果；大肠杆菌等真核生物具有对外源蛋白的糖基化功能，表达的蛋白与天然蛋白具有完全相同的功能，但通过文献和专利检索，尚未发现在大肠杆菌中表达RSV膜蛋白的研究。

绝大多数病原体是通过粘膜组织(呼吸道、消化道、生殖道等)感染人体的，RSV也不例外，为了有效地预防粘膜感染，抗原或疫苗必须加强激发局部粘膜组织的免疫应答。而粘膜免疫佐剂大肠杆菌热不稳定肠毒素(heat-labile enterotoxin，简称LT)的全毒素(含A、B两个亚基)或其B亚基能够协助抗原蛋白有效地刺激局部粘膜组织产生分泌型IgA(sIgA)以及机体的体液和细胞免疫应答。sIgA是粘膜组织表面的主要免疫分子，它可以中和粘膜部位的病原体，阻止病原体对粘膜的后继感染，同时机体对sIgA分泌有免疫记忆能力，反复的抗原或疫苗刺激可以提高特异的sIgA分泌量，增强粘膜的抗感染能力。