[发明专利]一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及物种内的鉴别技术，尤其是涉及一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法。

背景技术

泥蚶(Tegillarca granosa Linnaeus)俗称血蚶、宁蚶、花蚶、粒蚶，属于软体动物门(Mollusca)，瓣鳃纲(Lamellibranchia)，列齿目(Taxodonta)，蚶科(Arcidae)动物，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中国、韩国、泰国、菲律宾以及马来西亚等国家。在我国分布在山东半岛以南沿海。泥蚶作为水产业主导经济养殖贝类之一，味道鲜美、营养价值高、深受人们的喜爱，市场需求量较大，但是不同产地的泥蚶的味道和价格不同，如奉化和乐清的泥蚶血色鲜红、较淡，而荣成的泥蚶血色红，而广西北海、广东阳江和湛江泥蚶血色暗红，较深；并且乐清的泥蚶的味道比较鲜美，价格相应较高。

泥蚶雌雄异体，2龄性成熟，成熟后的泥蚶在壳长与壳高的比值上，汕头泥蚶、湛江泥蚶、韩国泥蚶和荣成泥蚶都相似，在壳表纵肋条数方面它们之间也未见显著性差异，奉化泥蚶、乐清泥蚶和福鼎泥蚶之间也在壳长、壳高和壳表纵肋条数无显著性差异，因此单从形态学是很难区分汕头泥蚶、湛江泥蚶、韩国泥蚶和荣成泥蚶，也难以区别奉化泥蚶、乐清泥蚶和福鼎泥蚶。另外当受精卵发育为稚贝时，各地的泥蚶的稚贝基本相似，很难从形态学加以区分，因此给泥蚶的养殖种类的鉴别带来不便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，该方法能充分区别不同海区的泥蚶的种类。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，特点是通过由所述泥蚶的消化腺组织的特异性蛋白(酶)和由所述的泥蚶的特异性的DNA序列来鉴别。

对所述的特异性蛋白用下述步骤进行标定：

a、选取组织：随机选取所述的泥蚶的消化腺组织并称重；

b、提取酶液：把所述的泥蚶的消化腺组织放入玻璃匀浆器中，然后加入重量是所述的泥蚶的消化腺组织的3倍的0.05％巯基乙醇水溶液，在冰浴条件下制成匀浆液；把所述的匀浆液放入温度为4℃的冷冻离心机中，用12000rpm离心30min，取得上清液，即为酶液。

c、电泳：在上述酶液加入适量的溴酚兰指示剂，然后用浓度为7～7.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳时间为3h～5h。

d、显色：将所述的聚丙烯酰胺凝胶置于染色液中，放在37℃恒温箱中，在所述的聚丙烯酰胺凝胶上形成显色的条带，随时观察所述的条带的显色结果，至所述的条带显色清晰为止，然后用7.5％的乙酸固定所述的条带，即为酶带。

所述的特异性蛋白为苹果酸脱氢酶(MDH)，所述的苹果酸脱氢酶的染色液组成为：NAD⁺(辅酶I)16mg、NBT(四氮硝基唑蓝)16mg、PMS(酚嗪甲硫酸盐)1.5mg、pH 7.0的1M的苹果酸钠5ml、pH 7.1的0.5M的Tris-HCl溶液(三羟甲基安基甲烷-盐酸)8ml，用蒸馏水定容至50ml。

所述的特异性蛋白为超氧化物岐化酶(SOD酶)，所述的超氧化物岐化酶的染色液组成为：NBT 22mg、V_B20.005g、Na₂-EDTA(乙二胺四乙酸)12mg和pH8.0的0.05M的Tris-HCl溶液8ml，用蒸馏水定容至50ml。

对所述的特异性的DNA序列用下述步骤进行标定：

e、取样：取所述的泥蚶足部的肌肉组织，剪碎所述的肌肉组织；

f、提取DNA：用常规方法从剪碎的所述的肌肉组织中提取DNA；

g、PCR反应扩增：用特异性引物对提取的所述的DNA进行PCR反应扩增，得到所述的PCR反应扩增的产物；

h、电泳：用1％～1.5％的琼酯糖凝胶对所述的PCR反应扩增的产物进行电泳10～20min，在所述的琼酯糖凝胶中加入溴化乙锭，从所述的琼酯糖凝胶中得到特异性谱带；

i、测序：在所述的特异性谱带上测得所述的泥蚶的特异性的DNA序列。

所述的特异性引物为

F：5’-GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3’；

R：3’-GGGTCGATGAAGAACGCAG-5’；从上海生工生物工程技术服务有限公司购得。