[发明专利]一种生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是四氢吡咯的前缀化合物，是生物体合成叶绿素、血红素、卟啉和维生素B₁₂等必不可少的物质。近年来ALA除作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药外，还在临床上用作光化疗剂。作为新一代光动力学药剂其具有毒性小，选择性高等显著优点，被用来治疗皮肤癌、膀胱癌、结肠癌和胰腺癌等多种癌症，在光化疗领域正逐步展现其巨大的应用性。

由于化学法合成ALA步骤繁琐且产率低，故生物合成方法正逐步展现出巨大优势。其一是生物诱变法，优化类球红细菌的突变株CR 720(Rhodobactersphaeroides CR720)培养条件，ALA的产量可达27mmol/L，但其培养条件复杂、周期长和成本较高。其二是基因工程方法，Mariet J.Vander Werf等(1996年)和Choi等(1999年)分别构建了含有类球红细菌Rhodobacter sphaeroides和大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicμm.的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(hemA)的工程菌，用于生产ALA，但酶活和产量均较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。

本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌是含有类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.1939。保藏日期：2007.1.25，分类命名：中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coliRosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，保藏单位地址：中国科学院微生物研究所。

上述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

上述5-氨基乙酰丙酸合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列或在其基础上减少、替代、增加一个氨基酸残基的具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的氨基酸序列。

生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的菌液中提取总基因组DNA，类球红细菌可由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买得到，保藏编号为CGMCC编号1.2174；

2)用聚合酶链式反应扩增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因；

3)将扩增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pMD-18T simple(商业化载体，从TaKaRa公司购买)连接，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

4)将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a(商业化载体，从德国Novagen公司购买)连接，构建出重组子pET28a-R.S.hemA；

5)将重组子pET28a-R.S.hemA转化至宿主菌中，即可。

为获得较高的5-氨基乙酰丙酸的产量，本发明中的宿主菌采用大肠杆菌Rosetta(DE3)(商业化菌株，从德国Novagen公司购买)。

本发明将一种类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因接入表达载体pET28a转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下，有较高的可溶性5-氨基乙酰丙酸合成酶表达，且经优化表达后胞外ALA的产量高达6.6g/L。

附图说明

图1是重组质粒pET28a-R.S.hemA的构建图，图中，R.S.hemA为5-氨基乙酰丙酸合成酶基因，Kana+为卡那霉素抗性基因，EcoRI和HindIII为限制性内切酶位点；

图2是工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA诱导表达示意图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明

实施例1

本发明生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1.类球红细菌基因组DNA的提取

1)将过夜培养的菌液放在1.5ml离增中，13,000×g离心1min后去上清；

2)用500μl TE缓冲液溶解后，加30μl 10％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，同时加3μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀后，37℃保温1h；