[发明专利]一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法。

背景技术

由弧菌属的细菌引起的弧菌病已经严重危害了海水养殖业。海洋弧菌中的溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌是主要的致病菌，其能感染石斑鱼、真鲷、鲈鱼、大黄鱼、牙鲆和大菱鲆等鱼类动物，也能感染虾、三疣梭子蟹、锯缘青蟹等甲壳类动物，以及文蛤，鲍，牡蛎等贝类动物，弧菌病具有发病快、传染性高和死亡率高的特点，感染弧菌病的海洋动物会发生表皮溃疡，烂尾，腹水，烂眼等症状，因此弧菌病对养殖海洋动物造成极大的危害，导致海水养殖业的极大经济损失。

对弧菌病的致病菌种的准确快速的检测是用药防治的依据，用多聚酶链反应(PCR反应)检测弧菌病的致病菌种，具有快速，敏感，特异性强的优点，PCR反应试剂盒是在PCR反应管中装有包括10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌去离子水混合的反应液，其检测方法是提取该弧菌病的致病菌种的DNA，把DNA加入到PCR反应试剂盒进行扩增反应，然后对扩增产物进行电泳，通过扩增产物与阳性标准品和阴性对照品的电泳结果对比判断，是否存在该DNA引物的致病菌种，从而找出弧菌病的致病菌种；但现有的PCR反应试剂盒中一般只含有一种致病菌种的单对引物，因此每个PCR反应试剂盒只能扩增一种致病菌种的DNA，即一次只能检测一种致病菌种，而导致弧菌病的致病菌种多种多样，弧菌病的症状表现也多种多样，这样就给选择用含有哪种致病菌种的DNA引物的试剂盒进行检测带来了困难，往往需要多次检测才能找到致病菌种，有些弧菌病是受几种海洋弧菌联合感染，因此就需要对几种致病菌种用不同的PCR反应试剂盒进行检测，才能检测出感染弧菌病的几种致病菌种，这样使得检测致病菌种的时间延长，检测费用也增加，并且耽误了弧菌病的防治时间，导致了弧菌病的扩散传染，从而导致感染弧菌病的海洋动物的病情加重和更多的海洋动物感染弧菌病，使得海水养殖业造成重大经济损失。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法，其具有能同时检测三种海洋弧菌的优点，缩短了检测弧菌病的致病菌种的时间，降低了检测成本。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒，包括PCR反应液，所述的PCR反应液由10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)、dNTP、Hot starTaq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌离子水配制而成，所述的致病菌种的DNA引物为下述三种弧菌的DNA引物，即：

溶藻弧菌的DNA引物：

上游引物为：5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，

下游引物为：5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，

哈维氏弧菌的DNA引物：

上游引物为：5’-gaagcagca ctc acc gat-3’，

下游引物为：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，

副溶血弧菌的DNA引物：

上游引物为：5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，

下游引物为：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。

Hot star Taq酶是5U/μl的DNA聚合酶的热启动版本。

dNTP是每种浓度为2.5m mol/L的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物。

三种弧菌的DNA引物是由生物公司合成，如表1所示，三种弧菌的DNA引物的两两之间无三对碱基以上的互补，引物的PCR反应退火温度为48℃～54℃，引物的PCR反应的扩增产物的片段长度大小接近，但两两之差仍大于100bp，因此能通过电泳把它们分开。

表1