[发明专利]一种通过诱变提高乳杆菌对亚油酸的耐受性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种通过微生物诱变手段提高生物合成共轭亚油酸产量的方法。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是由必需脂肪酸亚油酸(Linoleic acid，LA)衍生的共轭不饱和双键位于不同位置的18碳共轭双烯酸几何异构体的总称。其主要异构体位置有4种，即：C8，C10；C9，C11；C10，C12；C11，C13。而每种异构体又有4种几何异构体，即：cc，ct，tc和tt，其中cis9，trans11和trans10，cis12两种异构体被证实具有很强的生理活性。目前商业化生产CLA方法中最具优势的是微生物生物转化法。

微生物在培养方面灵活方便，许多微生物能利用自身的亚油酸异构酶(Linoleic acid isomerase，LAI)将LA转化成CLA。更重要的是微生物异构化作用具有选择性，其LAI能专一地把LA转化为具有生理活性的c9，t11-CLA。LAI可来源于多种微生物如乳杆菌(Lactobacillus)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)、丙酸杆菌(Propionibacterium)等，其中前三种微生物具有c9，t11 LAI活性，而丙酸杆菌有t10，c12 LAI活性。

微生物生物转化生产CLA的核心是菌种的选育。而转化LA合成CLA的菌种对LA的耐受性一般很低，即高浓度LA会杀死菌种，所以CLA产量无法提高。目前国内以LA为原料通过微生物生物转化生产CLA的产量一般低于50mg/ml。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种通过诱变手段提高乳杆菌对LA的耐受性，从而提高CLA产量的方法。

本发明的一种通过诱变提高乳杆菌对亚油酸的耐受性的方法，其包括以下步骤：

(1)将乳杆菌与葡萄糖、大豆粉混合，经200转/分钟振荡培养1小时后进行⁶⁰Co-γ辐射诱变，诱变温度为25℃，诱变时间为10分钟，诱变剂量为1500Gy。诱变后立即涂培养基平板；

(2)挑取步骤(1)诱变后活菌落进行离子束诱变：诱变温度为25℃，诱变时间为10分钟，诱变剂量为150×2.6×10¹³ions/cm²·s。诱变后涂培养基平板，所得活菌落即为对亚油酸具耐受性的突变乳杆菌。

步骤(1)的每升培养基成分为，葡萄糖100g、大豆粉80g、亚油酸200g、琼脂15g。

步骤(2)是将步骤(1)诱变后的菌落数为1×10⁶个/ml的乳杆菌30ml与葡萄糖120g、大豆粉50g定溶至400ml，放入1000ml三角瓶中，200转/分钟振荡培养1小时后进行离子束诱变。

步骤(2)的每升培养基成分为，葡萄糖100g、大豆粉80g、亚油酸350g、琼脂15g。

乳杆菌为1×10⁶个/ml。

乳杆菌15ml与葡萄糖60g、大豆粉25g定溶至200ml，放入1000ml三角瓶中。

所得的突变乳杆菌的应用，将脂肪酸亚油酸250克、无水乙醇100ml、葡萄糖200g、大豆粉65g与菌落数为1.5×10⁸个/ml的突变乳杆菌200ml混匀，用水定溶至1000ml，35℃静止培养13小时，得共轭亚油酸。

本发明的优点：

本发明通过两次诱变、两次筛选，得到对高浓度亚油酸充分耐受的突变乳杆菌，其对亚油酸的耐受浓度达到35％以上。通过本方法，提高了乳杆菌对LA的耐受性，使在培养基中可显著增加LA浓度，在摩尔转化率不变的情况下，CLA产量的提高幅度既为LA浓度的增加幅度。

具体实施方式

野生乳杆菌难以耐受高浓度亚油酸。将野生乳杆菌诱变后会形成表型各异的乳杆菌突变库，其中很可能含有少量对亚油酸耐受者，关键是将这部分在突变库中占极少比例的亚油酸耐受型突变乳杆菌从大量无义突变中筛选出来，如果亚油酸耐受型突变乳杆菌确实在突变库中存在，将突变库接入高浓度亚油酸培养基后，亚油酸耐受型突变乳杆菌就会生长，而大量无义突变乳杆菌则死亡，从而诱变并筛选得到亚油酸耐受型突变乳杆菌。

以下通过实施例进一步对本发明进行描述：

实施例1：

第一次诱变与筛选：将菌落数为1×10⁶个/ml的乳杆菌30ml与葡萄糖120g、大豆粉50g定溶至400ml，分成两份，分别放入1000ml三角瓶中，200转/分钟振荡培养1小时后。