[发明专利]一种胞内融合表达型前T载体及其制备与应用

权利要求书

1.一种胞内融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建DNA1： 5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCAT CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC-3’；(2)定点突变pET39质 粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改 变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的 pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39-1中，得到 pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达 型前T载体。

2.如权利要求1所述的胞内融合表达型前T载体，其特征在于所述胞内融合表 达型前T载体质粒图谱如图1所示。

3.制备如权利要求1或2所述的胞内融合表达型前T载体的方法，所述方法如 下：(1)构建DNA 1：5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGT CAT CATC ATCAT CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC-3’；(2) 定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列 不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除 XcmI位点的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39-1 中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信号肽基因，得到所述胞 内融合表达型前T载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1构建方法如下：

(1)引物A、B互为模板进行PCR1反应：

A：5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3’；

B：5’-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGAC CAGAACCAGAACC-3’；

PCR反应条件：94℃变性10min，48℃退火300s，72℃延伸10min；

(2)以pET11b为模板，利用引物Amp1、Amp2进行PCR2反应：

Amp1：5′-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3′；

Amp2：

5′-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3′；

(3)将PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2进行基因拼接，得到 所述DNA1；拼接反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退 火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的去除信号肽基因的方法如下： (1)以pET39为模板，以DsbA-1：5’-AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT -3’、DsbA-2：5’-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3’为引物进行PCR3反应， PCR条件：94℃3min；94℃30s、40℃30s、72℃1min，3个循环；94℃30s、 48℃30s、72℃1min，27个循环；72℃10min；4℃10min；(2)以NdeI 和BspTI酶切PCR3产物和pET39-2，使不含信号肽基因的DNA片段置换 pET39-2中原有的DsbA基因，得到胞内融合表达型前T载体。