[发明专利]一种胞内融合表达型前T载体及其制备与应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种可用于快速构建目的基因胞内融合表达工程菌的胞 内融合表达型前T载体及其制备与应用。

(二)背景技术

利用大肠杆菌制备具有药用价值的生物活性肽是基因工程最常用的 技术路线，但是目的基因表达产物在过表达时容易形成包含体，第一个氨 基酸一般为甲硫氨酸，与天然生物活性肽的氨基酸序列不一致，作为药用 时容易产生免疫原性。需要探索纯化工艺，难以表达分子量小的多肽。

利用融合蛋白表达策略可以很好地解决上述问题：目的基因融合表达 以后，可以利用融合伴侣携带的纯化标签，用亲和纯化工艺纯化目标蛋白， 快速高效纯化目标蛋白，融合蛋白用特异性蛋白酶酶切后可以得到氨基酸 序列与天然生物活性肽完全一致的产物，可以表达分子量小的多肽。还可 以利用融合伴侣增加表达产物的溶解性，从而有助于目标蛋白的纯化和后 续复性。

大肠杆菌二硫键形成蛋白DsbA是一种周质蛋白，天然的DsbA基因 上游有编码信号肽的基因序列，指导DsbA分泌于周质空间。DsbA具有 很好的溶解性，具有分子伴侣的功能，帮助其他周质蛋白形成分子内二硫 键。有文献报道，利用分子生物学技术，去除DsbA信号肽基因，定点突 变Cys残基，使不含Cys残基的DsbA在胞内表达，许多单独表达容易形 成包含体的生物活性肽与DsbA突变体融合后，表达产物以可溶性形式存 在。

将目的基因重组于无信号肽DsbA基因的下游，在胞内可溶性表达目 的基因，是新法制备各类生物活性肽的有效方法。但是常规的基因重组工 序复杂，需要涉及基因拼接，DNA重组等。虽然现代分子生物学技术为 这种重组提供了可行的多样的方法，但是过程较为复杂，耗时、耗材，需 要使用多种限制性内切酶、DNA纯化等工序。

T-载体是近年发展起来的一种用于直接克隆PCR产物的新型载体。 T-载体一般为线性，其分子末端各有一个3′dT(脱氧胸苷)突出。PCR 技术是分子生物学和基因工程研究中的一项基本技术，它被广泛用于体外 扩增已知或未知的特异DNA片段。利用Taq DNA聚合酶的末端转移酶 活性，在扩增DNA的3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸，通常为脱 氧腺苷酸(dA)。这个3′dA突出端被用于把PCR产物插入到插入位点 有一个3′dT突出的T-载体上。这样就将PCR产物以粘性末端连接的方 式直接克隆到载体上。这种方式不仅克服了常规克隆方法的缺点，而且操 作简便、方法快捷、连接效率高，因而其应用范围非常广泛。

有多种方法制备T载体，利用限制性内切酶制备T-载体是最为先进 的方式，其中XcmI最适合于制备T-载体，该酶的特异性识别序列为5′ CCANNNNN^*NNNNTGG 3′，N可以是A、T、G、C的任意一种。酶 法制备T载体首先要得到一个环状的前T质粒载体，经XcmI酶切两个位 点后，载体的大片段DNA线性化，而且两个3’末端均带dT，从而得到 可用于PCR产物快速克隆的T载体，如市场上供应pUCm-T。

目前市场上供应的主要是克隆型T载体，主要满足基因保存和测序 的需要，如果构建一种表达型T载体，将PCR产物直接连接于表达型T 载体上，使目的基因位于表达框架内，直接得到表达载体，即可一省略复 杂的DNA重组步骤。不仅克隆目的DNA，而且还可以直接表达目的基 因。

另外，用酶法制备T载体有可能存在以下几个方面的问题，一，如 果酶切质粒DNA质量不高，外源基因不能插入载体中，而载体转化感受 态细胞后能够在抗性平板上生长。pUCm-T载体设计了蓝白斑筛选方案以 筛选目的DNA片段是否插入载体，如果插入载体，编码半乳糖苷酶α肽 的基因LacZ被插入失活，细胞内没有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物 X-gal的筛选平板中白色菌落为插入失活阳性克隆，而兰色菌落为不含外 源基因的阴性克隆。这种方法需要使用价格昂贵的X-gal，制备蓝白斑 筛选平板也比较麻烦。在特定融合表达载体中不适合应用，需要采用别的 筛选方案。二，如果两个XcmI酶切位点空间位置较近，将影响载体的酶 切效率，即使载体DNA的纯度很高，酶的质量也很好，也会出现酶切载 体一“刀”的情况，这种线性的载体不能和PCR产物连接，而是载体自 连，从而导致阴性克隆的产生。

(三)发明内容