[发明专利]识别水禽共同IgY抗原的单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为识别不同水鸟和水禽共同IgY抗原的单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

野生水鸟和水禽(为书写简捷文中多处简称水禽)是禽流感病毒的自然储存宿主，对于禽流感病毒的繁殖、传播具有重要作用。资料显示，禽流感的16个HA亚型和10个NA亚型都已从野生水鸟、水禽体内分离到。在水鸟、水禽中，流感病毒主要在其肠道内复制，并通过粪便排出体外，再经污染的水源或空气进行传播。因此，为了有效控制禽流感病毒在家禽和人之间的流行，必需建立一套完整的监测体系，对野生水鸟、水禽的病毒抗体水平进行调查，掌握疫病发生发展规律，才能建立可靠的防治程序。对于流感病毒的诊断，现已建立了多种检测家禽流感病毒的检测方法如鸡流感琼脂扩散(AGP)、血球凝集抑制试验(HI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学检测技术。然而，由于水鸟和水禽的品种繁多，流动性大的特殊性，其流行病抗体的检测方法一直是困惑水鸟和水禽疫苗免疫效果评估和禽流感诊断的难题。研制高质量的识别不同水鸟和水禽共同IgY抗原的单克隆抗体，可为建立适用于基层使用的水鸟和水禽流感抗体检测器具提供诊断试剂，对水禽流行病的防治，尤其是禽流感的预防和控制有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以识别15种水鸟和水禽(简称水禽)共同IgY抗原的单克隆抗体，并提供其制备方法。15种水禽是斑头雁、鸿雁、鸬鹚、夜鹭、白鹭、遗鸥、斑尾塍鹬、中杓鹬、绿翅鸭、花脸鸭、赤颈鸭、斑嘴鸭、麻鸭、番鸭和鹅。

本发明识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体，是用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清IgY蛋白为抗原进行联合免疫，通过杂交瘤细胞方法纯化和筛选获得的，能特异识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。

本发明识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)用辛酸-硫酸铵盐析法从斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清中粗提IgY蛋白，经Superdex 200凝胶层析获得纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清IgY蛋白；

(2)用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅4种血清IgY蛋白为抗原，将此4种抗原按4种免疫组合免疫小鼠，诱导产生针对不同水禽的共同IgY抗原的抗体；4种免疫组合分别为：斑头雁IgY-鸭IgY-鹅IgY，斑头雁IgY-鸬鹚IgY-鹅IgY，斑头雁IgY-鸬鹚IgY-鸭IgY，鸬鹚IgY-鸭IgY-鹅IgY；

(3)通过杂交瘤细胞方法，以上述4种免疫组合小鼠脾细胞制备分泌抗水禽IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(4)用间接ELISA方法，以15种水禽的纯化IgY为检测抗原检测上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，筛选出识别15种水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。

本发明的抗水鸟和水禽共同IgY抗原的单克隆抗体是用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅等水鸟、水禽血清IgY蛋白为抗原进行联合免疫，通过杂交瘤细胞方法获得的，特异识别不同水鸟、水禽共同IgY抗原的单克隆抗体。

该单克隆抗体的具体制备方法进一步叙述如下：

采集斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅等水禽外周血，离心分离血清，用辛酸-硫酸铵盐析法从血清中粗提IgY蛋白，以Superdex 200凝胶层析进一步纯化，获得4种水鸟、水禽IgY纯化抗原。

用纯化的斑头雁、鸬鹚、鸭和鹅的血清IgY抗原按不同免疫组合联合免疫6-8周龄BALB/c小鼠，联合方法为：斑头雁IgY-鸭IgY-鹅IgY、鸬鹚IgY-鸭IgY-鹅IgY、鸭IgY-斑头雁IgY-鸬鹚IgY、鹅IgY-斑头雁IgY-鸬鹚IgY，诱导产生针对不同水禽共同IgY抗原的免疫应答。

取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合，以HAT培养基选择性培养后，经间接ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注入经降殖烷致敏的BALB/c小鼠诱生腹水，获得抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体，测定腹水效价。

用单克隆抗体亚型测定试剂盒鉴定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体Ig亚类，以ELISA测定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体对不同水鸟和水禽IgY的反应性，筛选识别不同水禽共同IgY抗原的单克隆抗体，Western blot鉴定抗水鸟和水禽IgY单克隆抗体识别的IgY轻链或重链。