[发明专利]溶血剂、白细胞分类试剂体系及分类方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血液细胞分析用试剂及分析方法，特别是涉及一种可用于血红蛋白浓度测定的溶血剂、一种用于白细胞分类的试剂体系以及使用该试剂对白细胞进行分类的方法。

背景技术

在临床检验领域中，对患者血液进行血红蛋白浓度测定和白细胞分类在多种血液疾病的诊断和治疗中具有重要意义。

在全自动血液分析装置上进行血红蛋白浓度测定和白细胞分类都涉及到溶血剂的使用。一方面溶血剂可以溶解红细胞，使细胞内的血红蛋白释放，用于血红蛋白的测定。另一方面，溶血剂破坏红细胞后可以消除红细胞以及红细胞碎片对白细胞分析的干扰，方便后续的白细胞计数和分类。

血红蛋白的测定方法很多，其中氰化高铁血红蛋白(HiCN)法为国际血液标准化委员会推荐使用的参考性方法。在这一方法中使用了非离子表面活性剂Triton X-100作为溶血剂。红细胞被破坏后，释放出的血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与氰(CN^-)离子结合形成稳定的氰化高铁血红蛋白(HiCN)。HiCN在波长540nm处有吸收峰，可用分光光度计进行直接测定或用HiCN参考液进行比色法测定。但是HiCN法中使用了剧毒品氰化钾，试剂常温下不稳定，易受多种因素的干扰，并且由于反应时间过长(约5分钟)，因此并不适用于全自动血液分析装置。

由于测定血红蛋白的HiCN法中的氰化物有剧毒，因此一些无氰血红蛋白测定的方法陆续被公布出来。例如，Oshiro等(Clin Biochem.1982Apr；15(2)：83-8.)介绍了一种无氰血红蛋白测定的方法。在这一方法中使用了阴离子表面活性剂月桂基硫酸钠(SLS，又称十二烷基硫酸钠，SDS)和非离子表面活性剂Triton X-100。SLS不仅可以与Triton X-100一同起到溶血剂作用，还可以与血红蛋白结合形成SLS-血红蛋白复合物。此复合物在535nm左右有吸收峰，但由于其摩尔消光系数还未确定，不能直接用吸光度值直接计算血红蛋白浓度，需用HiCN法定值的血液标本绘制标准曲线后间接计算血红蛋白浓度。另外，Zander等(Clin Chim Acta.1984 Jan16；136(1)：83-93)介绍了一种无氰血红蛋白测定的方法。这一方法中使用了非离子表面活性剂Triton X-100作为溶血剂。反应的最终产物为碱性高铁血红蛋白D-575(alkaline haematin D-575，AHD-575)，其在575nm有吸收峰，可用分光光度计进行直接测定。此外，Benazra等(美国专利4,853,338)也公开了一种无氰血红蛋白测定法。在这一方法中使用了季铵盐类阳离子表面活性剂作为溶血剂。

不过，由于表面活性剂的浓度过高或由于试剂体系的pH值过于极端，以上三种方法在溶解红细胞的同时也会对白细胞产生强烈的破坏作用。因此，虽然这些溶血剂可用于血红蛋白浓度的测定，但并不适用于对白细胞进行分类分析。

近年来，一些能同时测定血红蛋白浓度和对白细胞进行分类的方法被陆续公布出来。如美国专利6632676、2002/0098589、2004/0241769、RE38131、5958781、5882934、5866428、5834315、5612223、5242832、5250437等应用一种或多种季铵盐类、吡啶盐类阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂作为溶血剂，对血红蛋白浓度和白细胞分类进行分析。此类试剂仅能裂解红细胞，对白细胞有损伤但不严重。同时，由于表面活性剂对各类白细胞的损伤程度不同，因此会造成细胞的大小出现差异，从而通过细胞大小这个参数对白细胞进行两类或三类细胞分群。不过，这些方法中表面活性剂的使用浓度仍然偏高(几克到几十克)，并且有些方法中试剂体系的pH过于极端，可能会对自动血液分析装置的管路和器件造成损害。

然而，随着医学的不断进步，对白细胞进行两类或三类细胞分群已有些不能适应临床的需要，一些对白细胞进行四类或五类分群的方法已经被公布出来。

例如，Sakata等(美国专利5618733)公开了用于白细胞四分类的测定方法。方法中同样采用了季胺盐类阳离子表面活性剂作为溶血剂。溶血剂对各类白细胞的损伤不同，会使各类细胞皱缩的情况产生差异，从而使各类白细胞低角度散射光强度产生差异。同时，试剂中还使用芳香族有机酸或酸性色素对各类白细胞进行染色，从而使各类白细胞的高角度散射光强度也产生差异。通过高、低角度散射光的组合，可以对白细胞进行四类细胞分群。不过化学染料的使用不仅会增加试剂的成本，而且增加了仪器和试剂的复杂性。