[发明专利]一种淡水鱼类肝吸虫快速免疫检测试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种淡水鱼类肝吸虫快速免疫检测试剂盒，其盒体内设置酶联反 应板、酶结合物、洗涤液、底物液、显色剂、稀释液、终止液；其特征在 于，所述酶联反应板为从肝吸虫中提取可溶性抗原并纯化，然后包被所述 可溶性抗原制得的酶联反应板；所述酶结合物为辣根过氧化酶标记抗鱼免 疫球蛋白的酶结合物，所述可溶性抗原为可溶于水的肝吸虫成虫的抗原， 分步通过辛酸法和DEAE52离子层析柱层析纯化制得精制所述可溶性抗 原；

所述酶联反应板是在通用聚苯乙烯微孔板上包被可溶性抗原，然后在 室温静置12～24小时之后，采用0.1％～5％卵清蛋白或牛血清白蛋白封闭 2小时，然后冷冻真空干燥后装袋封口制成；其中，所述可溶性抗原是从感 染动物中获取肝吸虫成虫，并提取得到其可溶性抗原；包被液为含0.01％～ 1％可溶性抗原的缓冲液，所述缓冲液是0.01mol/L～0.15mol/L的磷酸盐、 硼酸盐或碳酸盐缓冲液，pH7.5～pH9.5；

所述酶结合物为采用纯化的鱼免疫球蛋白免疫动物，分离出抗鱼免疫 球蛋白，经纯化后采用辣根过氧化酶进行免疫标记制成；

对淡水鱼免疫球蛋白的制备纯化鉴定标记包括步骤：

首先，采用盐析法初级提取鱼血清中的球蛋白；其次，采用层析法进 一步纯化提取其免疫球蛋白；对纯化物进行分析鉴定，包括测定蛋白含量 和进行电泳分析；.抗鱼免疫球蛋白抗体的制备：用纯化的鱼免疫球蛋白免 疫动物；分离纯化抗鱼免疫球蛋白；酶免疫标记，采用改良过碘酸钠法进 行辣根过氧化物酶标记，然后分离纯化并进行鉴定；改良过碘酸钠法，是 取5mgHRP溶于0.2mol/L pH5.6的乙酸缓冲液0.5ml，再加入0.1mol/L0.25ml 的过碘酸钠混匀，加入抗鱼免疫球蛋白抗体约5mg混匀，调pH为9.0，4 ℃过夜，加入硼氢化钠0.5mg混匀，透析过夜，在以上溶液中缓慢加入等 体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许 0.02mol/L pH7.4PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过 夜；次日取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体结合物，以0.02mol/L pH7.4 PBS液加至5ml；效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保 存；

所述酶结合物是含0.05％～1％的辣根过氧化物酶标记抗鱼免疫球蛋白 的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；并且添加含量足以抑制细菌生长的防 腐剂，所述防腐剂是0.01％～0.1％的硫柳汞；

所述的试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；

所述洗涤液为包含有0.1％～1％表面活性剂的0.01mol/L～0.5m0l/L磷 酸盐缓冲液，pH6～8；底物液为0.1％～0.5％过氧化氢溶液；显色剂为 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；稀释液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；终止液 为1mol/L～2mol/L的硫酸或氢氧化钠。

2.一种用于非诊断目的的用于权利要求1所述的试剂盒的检测方 法，其包括步骤：

A1、酶联反应板每孔分别加稀释液1滴，加入待检的样本50ul，混 匀；其中，所述稀释液为0.01mol/L～0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6～8；

设置阴性孔、阳性孔及空白对照孔，阴性孔、阳性孔分别加稀释液 1滴，然后分别加入阴性对照品、阳性对照品各50ul，空白对照孔加入 稀释液2滴；

A2、充分反应后甩去孔内液体，每孔加洗涤液1滴后立即注满纯净 水，静置30秒后甩去，再用纯净水洗涤至少一次，甩去，拍干；其中， 所述洗涤液为包含有0.1％～1％表面活性剂的0.01mol/L～0.5mol/L磷酸 盐缓冲液，pH6～8；

A3、每孔加酶结合物2滴，充分反应后甩去孔内液体，每孔加洗涤 液1滴后立即注满纯净水，静置30秒后甩去，再用纯净水洗涤至少一次， 甩去，拍干；

A4、加底物液和显色剂各1滴，混匀，充分显色反应后加终止液1 滴，混匀，终止反应；其中，所述底物液为0.1％～0.5％过氧化氢溶液； 所述显色剂为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；所述终止液为1mol/L～2mol/L 的硫酸或氢氧化钠。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述充分反应为 37℃避光反应30分钟，所述充分显色反应为37℃避光反应10分钟。