[发明专利]杜鹃兰组培根状茎菌根化育苗技术

说明书

一、技术领域

本发明属于植物组培苗菌根化育苗技术领域

二、背景技术

杜鹃兰(Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)，又名毛慈姑、算盘七，为兰科毛慈姑属多年生草本植物，是我国珍稀濒危药用植物，也是贵州立体气候环境所形成的独特的地道中药材。杜鹃兰始见《本草拾遗》，以假球茎入药，其根茎含粘液及葡配甘露聚糖，具有消肿、散结、化痰、解毒、治痈疽疔肿、瘰疬、喉痹肿痛，淋巴结结核，蛇、虫、狂犬伤等功效。杜鹃兰对生态环境要求较严，喜阴凉湿润，目前主要依靠分株繁殖，繁殖系数极低，一般一个原球茎1年只生长一个新的球茎；杜鹃兰种子非常细小，只有结构简单的胚，胚乳退化，种子内没有足够的营养使之在自然状态下萌发形成原球茎和幼苗，利用种子自然繁殖无法成功；利用种子进行组培快繁成为解决这一问题的重要途径，但其移栽成活率低，而且生长缓慢。

国内外大量研究报道表明兰科植物与其菌根菌存在着密切的关系，无叶绿体及叶绿素的兰科植物终生依赖菌根菌提供营养；成年植株具有叶绿体和叶绿素的兰科植物，在种子及种子形成的根状茎(原球茎)阶段，还没形成叶绿体和叶绿素，完全依赖菌根菌提供营养，营菌寄生，成年后尽管形成了叶绿体和叶绿素，但其根系不发达，还依赖菌获得水份和无机盐，有些还从菌根菌处获得生长素类物质，菌根菌还可以将土壤和其他植物产生的营养物质转运给兰科植物，促进植物体生长和发育，有研究报道表明菌根菌还可以促进植物有效成份的提高。

鉴于菌根菌对兰科植物生长发育的重要作用，国内外学者对兰科植物菌根菌的应用作了大量的研究工作，尤其在腐生地生兰菌根菌的研究与应用上，取得了重大突破，如天麻菌根菌的应用打破了天麻不可人工栽培的神话。但一直以来，对成年能进行光合作用的兰科植物的菌根菌的应用未获得突破性进展，其主要原因在于没有从根本上弄清楚这类植物菌根菌的种类和动态变化，归其原因，一是主要采用表面消毒方法分离菌根菌，使一些生长慢的菌株无法分离，二是没有对菌根菌的最适感染期和多菌协同作用作深入的研究，无法建立适当的共培养体系，使大量的菌根菌被作为致病菌排除。这最终导致很多研究者筛选出的菌却不是真正的菌根菌，菌根菌的应用越走越艰难。

本发明采用单菌丝团分离技术从根中分离获得真正的菌根菌，根据分离获得的菌根菌的种类和比例，配制复合菌剂，将复合菌剂应用于根状茎育苗，省去了组培根状茎成苗时间(40～50天)，大大降低了能耗，同时还提高了成苗率、成活率和生长速度；复合菌剂应用于已经分化的组培苗的栽培，大大提高了移栽苗的成活率和生长速度。本发明首次解决了杜鹃兰菌根菌的应用问题，在理论上丰富了兰科植物菌根菌的应用研究，在应用上促进了杜鹃兰的产业化。

三、发明内容

本发明解决的主要问题是：菌根菌应用于杜鹃兰的产业化，即实现了杜鹃兰组培根状茎菌根化育苗及分化组培苗菌根化栽培。本发明涉及菌根菌的分离、菌根菌的培养、复合菌剂的制备、根状茎菌根化育苗、已分化组培苗菌根化栽培。整个技术将兰科植物菌根菌的多样性和复杂性简单化，紧紧抓住多菌协同作用的本质，为兰科植物菌根菌的应用提供了一个新的模式。

本发明中，术语“根状茎(Rhizome)”是地生兰组织培养的特定阶段，培养物呈根状，此阶段可切割培养，实现大量增殖，与附生兰的原球茎(Protocorm)阶段相似。自然界中所有地生兰都形成此结构，此阶段主要在土壤中，没形成叶绿体和叶绿素，完全依赖于菌根菌提供营养，此阶段植物与菌根菌关系密切。

(一)本发明适用范围

本发明适用于所有形成根状茎阶段的兰科植物组培根状茎菌根化育苗和栽培。

(二)本发明的技术方案

1、菌根菌的分离

采用单菌丝团分离方法进行菌根菌分离，为第一个关键，可以最大限度分离各种生长慢的菌株，而且分离的菌株可以肯定为内生菌根菌，无需进行菌株的筛选，可以直接进行复合菌剂的配制。

2、菌根菌的培养

各分离菌株为内生真菌，本身对氧气的需求量不大，而且所有菌株生长慢，培养时间长，易污染，防止污染是本步的关键，可以采用静置培养解决这一问题，这也是与其他真菌液体培养不相同的方法。

3、复合菌根菌液体菌剂的配制

这是本技术的第二个关键，大量研究表明单菌根菌与组培物共培养往往引起植株致病死亡，本技术不考虑单菌作用，而考虑多菌复合菌剂的协同作用，充分利用各菌的相互作用，有效平衡各菌生长势，促进菌根菌与植株共生平衡的形成，大大降低了致死率，这是本技术的第一个核心。

4、根状茎菌根化育苗