[发明专利]构建转纤维素酶基因酿酒酵母的方法

权利要求书

1.一种构建转纤维素酶基因酿酒酵母的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

--提取福寿螺的总mRNA；

--进行反转录合成cDNA；

--再通过PCR扩增出福寿螺纤维素酶基因；

--PCR产物的回收：用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目标带，

该纤维素酶基因片断命名为Hase；

--进行克隆和测序：

(1)连接反应，在PCR扩增的过程中，TaqDNA聚合酶具有在双链DNA3’末端加上一个非模板来源的核苷酸A的特性，使扩增产物具有A突出末端；将PCR产物与含有T末端的pMD18-T载体连接，完成PCR产物的克隆；

(2)感受态细胞的制备与转化：采用CaCL₂法制备感受态细胞；

(3)阳性克隆的筛选：用X-gal和IPTG对克隆进行初步筛选；

(4)质粒提取：从阳性克隆中取一个单菌落接种于5mL LB培养基，该培养基为含氨苄青霉素，50μg/ml；在37℃条件下，培养12-16小时；12000r/min离心，收集细胞；用碱法提取质粒，质粒经EcoRI、BamHI酶切消化，10μL酶切体系：质粒4μL，H₂O 4μL，BamHI缓冲液1μL，酶EcoRI、BamHI各0.5μL；再次验证是否有外源片段插入；

(5)测序：重组质粒序列经测序；再经过序列比对，验正分析其序列的正确性，得到的质粒命名为pMD18-THase；

--用BamHI和EcoRI酶对pMD18-THase和酵母表达质粒pYES2进行30℃酶切；

--表达质粒pYES2酶切后用磷酸酯酶(CIP)进行脱5’-P处理，再进行连接；

--构建重组pYES2-Hase质粒，用氯化钙法转化至JM109感受态细胞；

--宿主菌为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，将pYES2-Hase质粒转化至酿酒酵母菌株，进行重组Sc-Hase工程菌株的构建与筛选；通过PCR、酶切和测序检测，正确的重组酵母菌命名为Sc-Hase。