[发明专利]构建转纤维素酶基因酿酒酵母的方法

说明书

技术领域

本发明涉及构建转纤维素酶基因酿酒酵母的方法，属于转纤维素酶基因酿酒酵母的分子生物学技术方法。

背景技术

传统的酿酒技术是利用物料中的淀粉在酶的作用下转化成单糖，再在酿酒酵母的作用下进一步发酵成酒精。因为原料的淀粉是被细胞壁包围住的，不容易被利用，所以常要进行蒸料，使淀粉糊化，淀粉受热吸水膨胀，使细胞破裂，其中一部分淀粉被溶解。这样，淀粉粒就容易被液化酶和糖化酶作用而分解成单糖，进一步被酿酒酵母所利用发酵产生酒精，所以蒸料要蒸得熟透，否则就会造成液化和糖化困难。由此可见，传统的酿酒技术由于需要对淀粉进行蒸料处理，明显存在费事耗时，成本较高，而且效率较低的问题。

为提高酒精的发酵效率，所属领域技术人员采用了不同方法进行了研究，如中国专利200510014727.6公开了“一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法”，采用基因工程技术缺失编码镶嵌在细胞膜上的甘油通道蛋白基……。但它是通过基因缺失来调控其代谢路线，而且基因缺失对酿酒酵母的生活力也存在一定的影响。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种发酵反应稳定、周期短，酒精产出率高的构建转纤维素酶基因酿酒酵母的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种构建转纤维素酶基因酿酒酵母的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

--从动物中获得纤维素酶基因；

--利用载体将此基因融合到酿酒酵母基因组中。

其具体步骤包括：

提取福寿螺的总mRNA；进行反转录合成cDNA；再通过PCR扩增出福寿螺纤维素酶基因；PCR产物的回收：用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目标带，该纤维素酶基因片断命名为Hase；

进行克隆和测序：

(1)连接反应，在PCR扩增的过程中，TaqDNA聚合酶具有在双链DNA 3末端加上一个非模板来源的核苷酸A的特性，使扩增产物具有A突出末端；将PCR产物与含有T末端的pMD18-T载体连接，完成PCR产物的克隆；

(2)感受态细胞的制备与转化：采用CaCL₂法制备感受态细胞；

(3)阳性克隆的筛选：用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG对克隆进行初步筛选；

(4)质粒提取：从扩增到目的片段的阳性克隆中取一个单菌落接种于5mL LB培养基(氨苄青霉素，50ug/ml)，37℃，培养12-16小时；12000转/min离心收集细胞；用碱法提取质粒，质粒经EcoRI、BamHI酶切消化，10μL体系：质粒4μL，H₂O 4μL，BamHI缓冲液1μL，EcoRI、BamHI酶各0.5μL；再次验证是否有外源片段插入；

(5)测序：重组质粒序列测序；再验正分析其序列的正确性，得到的质粒命名为pMD18-Thase。

用BamHI和EcoRI酶对pMD18-THase和酵母表达质粒pYES2进行30℃酶切；表达质粒pYES2酶切后用磷酸酯酶(CIP)进行脱5’-P处理，再进行连接；

构建重组pYES2-Hase质粒，用氯化钙法转化至JM109感受态细胞；

宿主菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，将pYES2-Hase质粒转化至酿酒酵母菌株，进行重组Sc-Hase工程菌株的构建与筛选；通过PCR、酶切和测序检测正确的重组酵母菌Sc-Hase。

本发明对纤维素酶基因的序列设计引物，根据已经报道的福寿螺纤维素酶基因序列，按照一般引物设计原则，以编码区为模板设计引物，引物两端带有本序列中没有BamHI和EcoRI的酶切位点。先合成cDNA第一链，再以cDNA为模板用上游引物和下游引物将全长福寿螺纤维素酶基因编码区序列扩增出来，克隆测序，再酶切与表达载体连接，再转化到表达宿主中。

相比现有技术，本发明具有如下优点：

本发明从动物中通过RT-PCR获得纤维素酶基因，再利用分子生物学技术和方法，用载体将此基因融合到酿酒酵母基因组中，使纤维素酶消解细胞壁纤维素并转化为糖，也由于细胞壁的消解，可进一步充分利用细胞内的淀粉，提高酒精转化率，可提高酒精产出率15-25％。本发明让纤维素酶在酿酒酵母作用的同时，使细胞壁纤维素转化为二糖或单糖，并使细胞内的淀粉不断释放到反应体系中，进一步糖化发酵产生酒精。它具有发酵反应稳定，周期短，酒精产出率高的优点；因而，可有效降低酿酒成本。