[发明专利]一种生物催化制备(R)－2－羟基－4－苯基丁酸乙酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，属于生物催化不对称还原制备医药手性中间体技术领域。

背景技术

手性(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Benzenebutanoic acid，a-hydroxy-，ethylester，(aR)-)，分子式为C₁₂H₁₆O₃，分子量为208.25，CAS号：90315-82-5。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是合成众多血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利类药物的关键手性中间体。由于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯在该类药物合成中的重要性，吸引了许多人对其制备进行了广泛的研究，报道了大量的制备方法。

目前，(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的生产可以通过化学或生物拆分外消旋体、手性源合成和不对称还原等方法来进行。

1.化学合成和化学拆分方法。此法需要手性助剂的成本比较高，副产物比较多，污染较严重。

2.手性源合成方法。此方法需要较昂贵的手性源如D-苹果酸(EP0759424A)或者反应条件苛刻，如L-丝氨酸在无水低温条件下反应(JP62212329A)，因而实用价值不大。

3.酶法或者微生物整细胞不对称还原方法。虽然酶法反应具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。但是，氧化还原酶反应需要价格昂贵的氧化还原辅酶NAD⁺或者NADP⁺的参与，与纯酶相比，利用微生物整细胞进行催化反应具有明显优势。

基于上面的这些原因，利用微生物方法将α-羰基进行对映选择性还原是一种目前比较有效的方法。在研究与实践的过程中发现，多种生物材料可以用于2-羰基-4-苯基丁酸乙酯的转化。

瑞士Ciba-Geigy公司曾研究用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase)和甲酸脱氢酶，通过搅拌反应器的连续运作进行商品酶转化，获得了大于99％的ee值和大于91％的转化率，但商品酶价格高昂，而且在反应中还必须添加昂贵的辅酶NAD⁺作为辅助因子，因此该方法无法实际应用。

还有利用野生胡萝卜(Daucus carota)细胞催化，能获得较好的产率(90％)和ee值(99％)，但是却需要很长的反应时间(大约10天)(Chadha等，Tetrahedron：Asymmetry，7(6)，1571-1572，1996)。还有使用薄荷、烟草、栀子花等种类的细胞来进行催化还原的报道(Akakabe，Y.；Naoshima，Y.；Phytochem.，1994，35，661)。

利用微生物整细胞进行催化反应如利用小红酵母(Rhodotorula minuta IFO 0920)和假丝酵母(Candida holmii KPY 124020)在水/有机相中转化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，ee值分别达到95％和94％，缺点是转化率不高，最高58％(Shinobu Oda等，Biosci.Biochem.62：1762-1767，1998)；夏咏梅等利用面包酵母在水相和有机溶剂相中不对称催化转化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯得到产物对映体值为82.25％，产率为75.82％(化学研究与应用，2006，18(4)：426-430；食品与生物技术学报，2006，25(2)：66-69)。

从目前生物催化合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的报道和研究来看，缺乏高对映选择性和高产率的微生物酶源，因此，还需要对微生物进行筛选，找到一种稳定、催化效率更高更经济的菌株，并选择适当的反应条件，最大限度地提高对映体选择性和单位产率。

发明内容

本发明的目的是提供产高立体选择性羰基还原酶的微生物，提供一种新的能有效催化不对称还原反应制备手性羟基丁酸酯的方法，并利用该类微生物菌株催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不对称还原，以获得高对映体值、高反应摩尔转化率、高产物浓度的(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。

本发明的制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法是以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物进行制备，该方法以下步骤：