[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株RT－PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。

背景技术

2006年6月份以来，我国多个省份的养猪场、户爆发猪“高热病”疫情，据不完全统计，在6～9月份，我国共有发病猪约200万头，死亡40余万头，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。申请人研究发现，猪“高热病”疫情的原发病因是猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594～1680变异株)，并分离鉴定了该病毒(分类命名：繁殖与呼吸综合征病毒；拉丁文学名：Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期：2007年3月9日；保藏编号：CGMCC No.1964)。

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(Lv)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。近年来，我国学者相继分离鉴定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。PRRSV为单股正链RNA病毒，包含8个开放阅读框(ORFs)，其中ORF1编码有关RNA复制和转录的蛋白。NSP2属非结构蛋白，位于ORF1区，可能与PRRSV的嗜细胞性和嗜组织性有关。ORF5编码的糖蛋白GP5是主要的保护性抗原，可以诱导细胞凋亡和参与PRRSV粒子与受体的结合；PRRSV的变异分布于整个基因组，但以NSP2基因和ORF5基因变异最大。PRRSV美国分离株MN184和我国分离株HB-2，其NSP2均缺失数量不等的氨基酸；不同的PRRSV分离株，其GP5氨基酸序列存在数量不等的点突变。

2006年9月，申请人研究发现，全国各地发生的猪“高热病”的病原均为NSP2基因缺失第1441～1443位核苷酸和第1594～1680位核苷酸的美洲型PRRSV，该病毒的致病力超过已知的PRRSV强毒株。申请人针对该病毒建立了特异性RT-PCR检测方法，用于诊断和检测该病毒感染。

此前，我国尚无PRRSV超强变异株(NSP21594～1680变异株)的特异检测技术。常规RT-PCR技术不能区分PRRSV超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)和非变异毒株，因此不能特异地检测猪PRRSV超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)；基因测序技术可以鉴定该病毒，但需要至少4天时间才能够鉴定出本病毒。

本发明针对PRRSV超强变异株的基因在Nsp21594～1680位核苷酸发生缺失的特征，根据缺失位点的上、下游的核苷酸序列，设计一系列PCR引物，采用RT-PCR方法扩增Nsp2基因，通过检测扩增片段的分子量大小，判断是否存在Nsp21594～1680位核苷酸发生缺失的超强变异病毒株，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)。目前其他RT-PCR方法不能解决该问题；基因测序技术需要时间较长，且费时、费力、成本高。因此，该技术可对PRRSV超强变异株的诊断和监测起到重要作用。

发明内容

本申请涉及的猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(NSP2 1594～1680变异株)，保藏信息如下：

分类命名：猪繁殖与呼吸综合征病毒

拉丁文学名：Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2007年3月9日

保藏编号：CGMCC No.1964

理化特性该病毒直径40～80nm、为有囊膜的球形或椭圆形病毒粒子。不能凝集恒河猴、猪、犬、家兔、豚鼠、SD大鼠、Balb/c小鼠、鸡、人O型的红细胞。

培养特性病毒可在Marc-145细胞中培养增殖，并产生CPE(细胞聚集、隆起、细胞轮廓模糊、变圆、皱缩、核固缩，呈灶状脱落)，在PK-15、ST、BHK21、VERO、MDCK等其他5种细胞上均不产生CPE。

分离鉴定：