[发明专利]一种HPV L1蛋白原核表达的高密度发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体地涉及HPV L1蛋白原核表达的高密度发酵方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human papilloma virus；HPV)可导致人类的多种疾病，包括良性疣和癌症。因此，HPV的预防性疫苗研究成为当前的热点研究领域。L1蛋白是HPV的两个衣壳蛋白之一，72个L1蛋白五聚体就形成了HPV病毒颗粒的外壳，这使得L1蛋白成为重要的候选免疫原。

目前，采用原核表达系统来生产HPV L1蛋白存在着表达质粒易丢失、蛋白产量低、生产成本高等问题，严重制约了其工业化应用。本发明从控制发酵参数入手，通过改良发酵培养基，有效解决了上述难题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种HPV L1蛋白原核表达的高密度发酵方法及改良的培养基，本发明的另一目的是提供一株高效表达HPV L1蛋白的工程菌。

(二)技术方案

本发明提供了一种HPV L1蛋白原核表达的高密度发酵方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)种子活化：将表达HPV L1蛋白的工程菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)CGMCC1944(该菌株已于2007年2月9日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1944)在固体2YT培养基上活化(指在25-37℃下，在2YT平板上划线培养12小时)，然后挑单菌落到10ml YTL液体培养基上，在25-37℃下培养24-36小时；再将得到的种子液按体积比5％的接种量接种至YTL培养基中，在30-37℃下培养8-12小时；

(2)接种：向发酵罐中填充YTL培养基，然后按体积比5％-10％的接种量将上述活化好的种子液接种至液体YTL培养基；

(3)发酵：向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气，通气量4-8L/min；发酵温度25-37℃，搅拌转数200-800rpm，溶氧控制在30％-100％，pH控制在6.2-7.8，发酵时间20-30小时；当OD_600nm＝2-4时开始补料，补料的流加速度是25-400ml/h。

(4)诱导HPV L1蛋白的表达，并进行蛋白纯化，得到目的蛋白。

在上述方法中，所用到的培养基组成为：

2YT：胰化蛋白胨(进口，Oxoid公司生产)16g，酵母提取物(进口，Oxoid公司生产)10g，NaCl 5g，H₂O 1L，硅油消泡剂0.2ml；

YTL(所有原料国产)：Na₂HPO₄.12H₂O 6-10g，KH₂PO₄ 1-3g，胰化蛋白胨7-10g(华美生物公司生产)，酵母提取物3-6g(华美生物公司生产)，65-75％的乳酸钠10-20g，MgSO₄ 0.4-0.8g，NH₄Cl 2-3g，H₂O 1L，硝酸消泡剂0.2ml，其中Na₂HPO₄.12H₂O和KH₂PO₄要溶于200mL水中，单独灭菌。

补料培养基：蛋白胨72g，酵母提取物72g，甘油或65-75％的乳酸钠100-200g，NH₄Cl 2-3g，H₂O 1L。

其中，发酵培养基(即YTL培养基)和补料培养基为本发明的发明人在已知培养基的基础上进行改进得到的，在国内外未见相同的报道。

优选地，本发明所述的方法中，步骤(3)中搅拌转数为400-600rpm，pH控制在6.5-7.5。

优选地，本发明所述的方法中，步骤(3)中通入的空气/氧气的混合气中空气∶氧气＝1∶1-1∶10(体积比)。更优选地，在发酵前期(指溶氧高于30％前)通入空气，发酵后期(指溶氧高于30％时)通入空气/氧气的混合气，控制溶氧始终维持在30％-100％。

优选地，本发明所述的方法中，步骤(3)中补料的流加速度控制方法为：补料开始后的2-4小时控制流加速度为25ml/h，之后每2-4小时流加速度增加25ml/h-100ml/h。