[发明专利]人CD40L表达体系及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种真核表达体系，尤其涉及一种人CD40L DNA表达体系及其制备方法。

背景技术

DNA重组技术(recombinant DNA technology)是生物工程体系中的重要组成部分。是指在基因水平上，根据需要以人工的方法取得供体上某个或某些有用的基因，在体外重组于载体DNA分子，然后将重组DNA转入受体细胞进行无性繁殖或行使正常功能。

DNA重组技术主要包括：①人工合成或从生物基因组中，获取带有目的基因的DNA片段；②选择或改造作为载体的DNA；③将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标记的载体分子上，即DNA重组；④将重组DNA分子引入受体细胞；⑤从大量的细胞繁殖群体中筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞并扩增，进一步抽提、纯化、扩增得到目的基因；⑥将目的基因克隆到表达载体，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下呈现功能表达，产生出人类所需的物质。

该技术已广泛用于基因工程药物及各种疫苗的制备等研究领域。

CD40L(CD154)，是由261个氨基酸构成的II型跨膜糖蛋白。它主要表达于激活态T淋巴细胞，尤其是CD4⁺T淋巴细胞表面。在免疫系统，该分子与相应细胞CD40受体的相互作用对调节体液与细胞免疫反应具有枢纽作用。一定状态下，CD40L与肿瘤细胞表面CD40结合，可以直接抑制肿瘤细胞增殖，增加抗肿瘤制剂的敏感性。更重要的是，CD40L一方面可以诱导DC细胞成熟，延长DC细胞生存期，上调共刺激分子及内源性肿瘤肽表达；另一方面可增加一些免疫刺激因子的分泌。从而提高DC的抗原呈递效应，促进T效应细胞的增殖，增强了宿主抗肿瘤免疫的能力。以CD40L为组件的抗肿瘤疫苗的动物实验研究日益受到重视，诸多资料表明，动物实验中的抑癌效果令人欣慰，有望拓展于临床领域。因此，建立人CD40L表达体系，为进一步的临床研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种人CD40L表达体系，使人CD40L在所需的受体细胞中进行表达，达到以人工的方式适度调整某些免疫反应的目的，为相关临床免疫研究奠定基础，该体系具有以下特征：

含真核启动子的表达载体；

编码SEQ ID NO：1的特异性人CD40L目的基因片段；

所述的表达载体在多克隆位点与CD40L目的基因片段重组。

本发明的优选实施例中，上述的CD40L目的基因片段SEQ ID NO：1序列为NCBI核酸数据库收录的编号为BC071754 CD40L序列中所载取的40至915间基因序列，共876个碱基。

本发明的优选实施例中，上述的表达载体含CMV和SV40真核启动子。

本发明的优选实施例中，上述的表达载体在多克隆位点具有Nhe I和Kpn I酶切位点。

本发明的优选实施例中，上述的表达载体为pcDNA3.1(+)载体除去多克隆位点Nhe I与Kpn I之间16个碱基的载体部分。

本发明的优选实施例中，上述的CD40L目的基因片段是由人激活态T淋巴细胞中获取。

本发明的另外一个目的是提供一种制备上述的人CD40L表达体系的方法，制备中所用试剂均为市售分析纯制剂。其主要包含以下步骤：

(1)CD40L目的基因的克隆；

(2)CD40L与pMD-18-T重组克隆载体的构建；

(3)pMD-18-T-CD40L重组克隆载体的鉴定与纯化；

(4)重组CD40L-表达载体的构建；

(5)重组CD40L-表达载体阳性质粒的鉴定与纯化；

(6)重组CD40L-表达载体阳性质粒转染靶细胞株；

(7)靶细胞株中CD40L目的基因表达的检测。

本发明的优选实施例中，上述的CD40L目的基因的克隆引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

其中，为便于定向重组载体的筛选，上述的SEQ ID NO：2所示序列的5’末端和上述的pMD18-T载体分别设有酶切位点Nhe I和Kpn I。

本发明的优选实施例中，上述的重组CD40L-表达载体中的表达载体为pcDNA3.1(+)载体除去多克隆位点Nhe I与Kpn I之间16个碱基的载体部分。

本发明所述的人CD40L表达体系，是借用基因转染技术，将该基因转入靶细胞，使CD40L在所需的细胞中表达，可以利用CD40L对免疫功能的调节机制，研究相应临床免疫，尤其是相关抗肿瘤免疫研究。