[发明专利]靶核苷酸序列的检测方法、检测靶结构及制法以及试剂盒

说明书

本申请是同名中国专利申请200480000375.2号的分案申请，原申请国际申请号PCT/JP2004/003777，国际申请日2004年3月19日。

技术领域

本发明涉及到对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法、通过该方法制造的检测靶结构、使用该结构的靶核苷酸序列检测方法、检测靶结构制造用试剂盒、以及靶核苷酸序列检测用分析试剂盒。

背景技术

为了检测含有特定核酸序列的核酸链，一般都采用以下那样的手段。那样的方法，例如使用与检测对象的核酸链互补的1对引物进行扩增后，通过电泳检测其存在的检测方法、使用与检测对象互补的靶核苷酸序列的核酸链作为核酸探针固定化的基体，进行杂交的方法。另外，一般来说，在这些检测中使用的引物或核酸探针是具有15个碱基左右以上连续的特异序列的寡核苷酸。然而，那样的寡核苷酸即使利用已有的引物或核酸探针设计软件等可以进行设计，但在反应体系中在靶核苷酸序列中存在高级结构，或存在部分类似的序列的情况多。这样的场合下，会引起错误退火、自杂交等。象这样的以往方法，要高精度、高效率地检测目的靶核苷酸序列是不容易的。另外，为了设定最适检测条件，必须要花费许多时间和费用。

例如，作为高灵敏度而且高效率地检测核酸序列的方法，到目前为止提出了“杂交法”(参照特开平6-70799号公报)和“利用部分双链DNA的DNA检测方法”(参照特开平11-332566号公报)等。这些方法是在使含有与要检测的靶核酸一部分区域互补的序列的核酸探针和该靶核酸进行杂交时，在该杂交反应前和杂交反应时，添加与上述核酸探针的结合部位以外的靶核酸的序列互补的核酸链，退火后在一部分形成双链的方法。这些方法目的在于通过在任一个靶核酸的序一部分形成双链的方法。这些方法目的在于通过在任一个靶核酸的序列上，将核酸探针识别的区域做为一条链，而将剩下的区域做成双链，防止非特异的杂交。

然而，在上述方法中，实际使用时还存在很多要解决的问题点。那样的一些问题就象下面所示的那样。

(1)由于必须要以单链状态制备“靶核酸”和“保护链”两种分子，所以工序数变多；

(2)靶核苷酸序列的设计被限定。为了避免非特异性杂交，在杂交反应液中希望除了核酸探针之外只存在游离的单链核酸分子。然而，在对靶核酸和保护链进行退火时，由于在液体中依靠分子运动使得长的核酸之间结合，受到分子内高级结构等影响，不能进行理想的杂交，所以杂交的效率显著低下的情形很多。为了防止这种现象，靶核苷酸序列的设计就受到限定了；

(3)靶核酸作出需要花费很多时间。这是由于例如从使保护链和靶核酸之间形成正确碱基对的目的考虑，就必须花费长时间进行退火反应的工序；

(4)特别是“利用部分双链DNA的DNA检测方法”(参照特开平11-332566号公报)，需要使用非对称PCR作出靶链和保护链。因此，即使解决了上述(2)的问题可以做到定性分析，也不能适应社会需要的高定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法、通过该方法制造的检测靶结构、使用该结构的靶核苷酸序列检测方法、检测靶结构制造用试剂盒、以及靶核苷酸序列检测用分析试剂盒。

本发明为了解决上述课题，发现了以下手段。

如果按照本发明的第1个方面，作为对靶核苷酸序列检测有用的检测靶结构的制造方法，提供包括在可获得的适当延伸反应的条件下使与位于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的引物、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，通过该反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

如果按照本发明的第2个方面，作为对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法，提供包括在可获得的适当延伸反应的条件下使与位于靶核酸的5’端附近的靶核苷酸序列3’端以外的3’侧的序列互补，而且在3’末端含有不可延伸的修饰的终止核酸，与靶核酸的3’端附近的序列互补的引物、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，通过该反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列区域的靶核酸和与该靶核酸互补的保护链的检测靶结构的方法。