[发明专利]布鲁氏菌弱毒疫苗突变株及其构建方法与应用

权利要求书

1、布鲁氏菌弱毒疫苗突变株，是将布鲁氏菌弱毒疫苗株缺失bp26、wboA、omp31、P39或pgm基因后得到的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。

2、根据权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株，其特征在于：所述布鲁氏菌弱毒疫苗株为羊种M₅株、人用104M株或猪种S₂株。

3、根据权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株，其特征在于：为生物保藏号为CCTCC M207030的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株M5-26。

4、一种构建权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株的方法，包括以下步骤：

1)分别依据布鲁氏菌全基因组序列中靶基因bp26、wboA、omp31、P39或pgm的上、下游已知区域的核苷酸序列，各设计两对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度为500bp至1000bp的同源性核苷酸片段；为定向连接成含缺损基因的同源性核苷酸片段，所述扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端添加一种相同的限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，所述扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端添加另一种相同的限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，此外，为防止改变下游基因的读码框架，扩增上游同源性核苷酸片段的逆向引物与扩增下游同源性核苷酸片段的正向引物的5’末端在缺失目的基因相应区域的间隔碱基数为3的倍数；

2)以布鲁氏菌的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段，再将这两个上、下游同源性核苷酸片段定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段；

3)将步骤2)获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入自杀载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体；

4)将步骤3)构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体转化布鲁氏菌，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。

5、根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端添加的限制性内切酶识别位点为BglII识别位点，其保护性碱基为序列表中的序列5，扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端添加的限制性内切酶识别位点为BamH I识别位点，其保护性碱基为序列表中的序列6。

6、根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中依据bp26的上游已知区域的核苷酸序列设计的PCR引物为序列表中的序列1和序列2，依据bp26的下游已知区域的核苷酸序列设计的PCR引物为序列表中的序列3和序列4。

7、根据权利要求4或5或6所述的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中用于构建含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体的出发载体为pKNG101或pCVD442。

8、根据权利要求4或5或6所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中用于转化含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体的布鲁氏菌出发菌株为布鲁氏菌羊种M₅株、人用104M株或猪种S₂株。

9、权利要求1或2或3所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株在制备布鲁氏菌预防性疫苗中的应用。

10、权利要求1或2或3所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株在制备鉴别布鲁氏菌疫苗免疫和自然感染试剂中的应用。