[发明专利]一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是一种非常令人感兴趣的营养添加剂，大量的体内体外试验证明CLA能诱导能量利用并导致体重的下降，且不储存脂肪；能缓和如厌食、蛋白质分解等免疫反应的副作用；具有抗突变、抑制癌细胞中的蛋白质和核酸的合成，此外CLA还可提高人类某些生理状态，如提高体内维生素A的水平。由于CLA具有丰富的营养价值，同时食品中含量很低，所以如何低成本、高纯度地制备CLA成为研究焦点，CLA的商业化生产方法为亚油酸的碱异构化法。碱异构化法的原料是含有77％亚油酸的葵花籽油，经过KOH(或NaOH)强碱的作用转化成CLA，这种方法比较简单，且产物易于处理，在商业上应用较广，但其缺点是产生一系列具有位置和几何异构的CLA混合物。相比之下，利用乳酸菌中提取的亚油酸异构酶生产CLA具有重要意义。因为CLA的微生物异构化具有选择性，其亚油酸异构酶能专一地作用于脂肪酸的12C双键，而不是9C双键，因而能把亚油酸主要转化为c9，t11-CLA，而且微生物在培养方面较为灵活、方便。而乳酸菌兼性厌氧，培养条件易于控制，是人体益生菌，可直接用于食品、保健品和药品。同时乳酸菌含有的亚油酸异构酶对作用底物具有很强的专一性。

常用的酶催化反应介质有水、有机溶剂(丙酮、正己烷等)、超临界流体(主要为超临界二氧化碳，SCCO2)。由于油脂在水中的溶解度小及微生物污染等问题，以水为反应介质的酶催化反应受到了一定限制。近年来有研究表明酶在有机溶剂中能够保持良好的催化活性，因此人们选用有机溶剂代替水为酶催化反应介质。但有机溶剂存在如下问题：其一，较大的多相传质阻力限制了反应速率的提高；其二，溶剂残留降低了产品质量，被“绿色食品”市场所不容；另外，有机溶剂较高的价格使产品成本大为增加。作为酶催化反应介质之一，超临界二氧化碳(SCCO₂)因具有如下优点而日益受到人们的重视：

1、二氧化碳廉价、阻燃、化学惰性；

2、SCCO₂具有高扩散系数、低粘度和低表面张力等特性，可有效降低反应过程中的传质阻力，有利于反应进行；

3、二氧化碳的临界温度(Tc＝304.19K)接近室温，临界压力(Pc＝7.382MPa)也比较适中，操作安全；

4、以SCCO₂为反应介质，反应后期的产物提纯与溶剂分离过程简单：

5、SCCO₂无毒，随着人类对自身健康和对环境保护的日益重视，它的应用前景将更为广阔。

由于超临界二氧化碳具有上述优点，因此，越来越多的研究人员将其作为酶催化反应介质。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法。

本发明所提供的利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法，是将亚油酸和亚油酸异构酶在超临界二氧化碳中反应1至3小时，得到共轭亚油酸；所述反应的压力为25-35Mpa，反应温度为32-44℃。

上述方法中，反应条件具体可为1)所述反应温度为32℃，反应压力为25Mpa，反应时间为2小时；2)所述反应温度为40℃，反应压力为35Mpa，反应时间为3小时；3)所述反应温度为44℃，反应压力为30Mpa，反应时间为1小时。

所述亚油酸和亚油酸异构酶的配比可为2-5mg亚油酸∶1-3mL亚油酸异构酶(酶比活力为6.84U/ml)；所述亚油酸和亚油酸异构酶的配比优选为5mg亚油酸∶2mL亚油酸异构酶。

所述亚油酸异构酶可按照包括如下步骤的方法从亚油酸异构酶产生菌的菌体中提取纯化：

1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；

所述超高压均质法的均质工作压力为130-160MPa，均质阀片直径为0.05-0.15mm；

2)将步骤1)得到的粗酶液进行(NH₄)₂SO₄饱和度为40-90％的(NH₄)₂SO₄分级沉淀，收集沉淀，用磷酸钾缓冲液悬浮，得到酶液；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0；