[发明专利]表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及工程菌及其构建方法与应用，特别是涉及表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与其在发酵生产聚羟基脂肪酸酯中的应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一种能由许多微生物合成的胞内聚酯，在微生物胞内以颗粒状的内含物形式存在，是细菌胞内的一种碳源和能源的储备物。由于其具有与塑料相近的物理材料性能及生物可降解性能，因此被称之为生物可降解塑料。聚羟基脂肪酸酯的化学结构式如式I所示：

(式I)

其中，m＝1、2、3或4，通常m＝1；n＝100-10000，表示聚合度；R为高度可变侧链，可以是饱和或不饱和、直链或支链、脂肪族或芳香族的基团。

近年来，组织工程领域的研究结果表明PHA还具有良好的生物相容性，是非常有潜力的生物医用材料。PHA按照其单体结构的不同，可以分为以下三类：短链PHA，其单体的碳原子数小于6，如聚3-羟基丁酸酯PHB，3-羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV；中长链PHA，含有碳原子数不小于6的单体；短链中长链共聚PHA，既含有短链PHA单体，又含有中长链PHA单体，这两种单体通过随机共聚的形式连接，如3-羟基丁酸己酸共聚酯PHBHHx。不同单体组成的PHA具有不同的物理性质，例如强度、延展性、结晶速率等。微生物的许多代谢途径，如β氧化途径等，与PHA的生物合成过程密切相关。脂肪酸是PHA生物合成的合适碳源，脂肪酸代谢过程的中间产物可以通过几条不同的代谢途径生成各种羟基脂肪酸单体用于PHA的合成。这三种PHA的物理性能差异很大。目前，PHA主要是从微生物中提取的，但现有的提取方法都存在较大缺陷，如回收率不高、产品纯度低、提取后产品分子量降低等，加上使用的许多有机溶剂毒性较大，沸点较低，提取过程需要高压，给生产带来安全隐患。对于中长链的PHA，现有的提取方法通常得到PHA沉淀是粘性很大的物质，较难分离和干燥，给提取带来一定的困难，而且纯度较低，带有较多杂质，限制了其在医学领域中的应用。因此，迫切需要一种工艺简单，成本低，且产率较高的生产聚羟基脂肪酸酯的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可高效表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的专用表达工程菌。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌，是抑制或敲除产聚羟基脂肪酸酯细菌中的与脂肪酸β氧化代谢途径相关的一个或多个基因后得到的产聚羟基脂肪酸酯菌突变株。

所述与脂肪酸β氧化代谢途径相关的基因，可包括3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase)(fadA，GenBank号：1044992)、3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)(fadB，GenBank号：1044991)、3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase)(pcaF，GenBank号：1041755)、3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase)(fadAx，GenBank号：1045080)、乙酰辅酶A酰基转移酶基因(acetyl-CoA acetyltransferase)(phaD，GenBank号：1046928)和酰基辅酶A水合酶/异构酶enoyl-CoA hydratase/isomerase(fadBlx，GenBank号：1045082)等基因。