[发明专利]创伤弧菌的一管法半巢式PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1、一种一管法半巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：

(1)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B；试剂A含有NaCl 200～350mmol/L，ph＝8.0的三羟甲基氨基甲烷50～100mmol/L，乙二胺四乙酸二钠50～100mmol/L；试剂B含有浓度为5～10％的十二烷基磺酸钠水溶液；

(2)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂C和反应引物试剂D和E；试剂C包括10×反应缓冲液5μL、500～1000μmol L^-1的dNTPs、1～5m mol L^-1的MgCl₂，1～2个单位的热聚合酶和适量的灭菌超纯水；试剂D包括引物Vvg1和Vvg2，浓度均为5～20μmol L^-1，

Vvg1特指5’-CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC-3’；

Vvg2特指5’-GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT-3’；

试剂E包括引物Vvg3，其浓度为10～30μmol L^-1，

Vvg3特指5’-AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT-3’；

(3)电泳和显色试剂，包括试剂F、试剂G、试剂H和试剂I；试剂F：为20-50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-醋酸和乙二胺四乙酸二钠，浓度分别为0.01～0.04mol/L和0.001mol/L；

试剂G：含0.1～0.5g琼脂糖；

试剂H：Nucleic acid ClearDNA stain；

试剂I：标准分子量DL2000。

2、一种使用权利要求1中的试剂盒检测创伤弧菌的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)样品处理：取1～5ml水样样品，用50～1000μL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀，1000～3000g离心3～10分钟，取上清转管，8000～15000g离心3～10分钟，弃上清；

2)DNA提取：用50～150μL试剂A再次悬浮沉淀，并加入5～10μL试剂B，混匀，室温放置5分钟以上，沸水浴中保温10～30分钟；8000～15000g离心10分钟，取上清转管，并加入上清2/3体积的异丙醇；混匀后室温放置10分钟，8000～15000g离心5分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10～50μL灭菌双蒸水，即制成了DNA提取液；

3)聚合酶链式反应扩增：取0.5～2μL DNA提取液和40～45μL试剂C、1～2μL试剂D混合；在热循环仪上按以下方法进行扩增：首先以94℃预变性1～4min；接着以92～95℃变性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，共扩增5～15个循环；加入1～2μL试剂E，以92～95℃变性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，再扩增20～40个循环；最后72℃延伸5～10min，4℃保存；

4)电泳和显色检测：将试剂F稀释成1倍的电泳缓冲液，取10～40mL的1倍电泳缓冲液和试剂G充分混匀后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平电泳槽制胶，凝固后加入适量的1倍电泳缓冲液，使液面高于胶面0.5～2mm；取5～20μL扩增后的样品与0.8～4μL试剂H在保鲜膜上混合，静置5～10min以上，将此混合样品加于上述胶孔中，同时，在另一胶孔中加入1～5μL的试剂I；50～100V电泳20～30min；紫外光下检测，如果同时有一条700核苷酸对和一条350的核苷酸对条带，说明样品已被创伤弧菌感染或污染；如果样品中只有一条350核苷酸对条带，则需要用引物Vvg1和Vvg3做另一扩增反应实验，如果样品中能产生一条700核苷酸对的条带，同样说明样品有创伤弧菌感染或污染；反之则没有。