[发明专利]创伤弧菌的一管法半巢式PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用一管法半巢式PCR检测创伤弧菌的试剂盒，进一步涉及使用一管法半巢式PCR检测试剂盒检测创伤弧菌的方法。

背景技术

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种人兽共患的病原，主要分布于世界各地的暧水性近海与海湾的海水、海底沉积物及动物体内(Pfeffer et al，2003；郑国兴等，1999)，可通过进食生的或未熟透的海鲜食物或通过破损的皮肤接触海水而引发感染，能强烈引起人类(Nascimento et al，2001)和多种水生动物如石碟鱼(沈志强等，2001)、军曹鱼(简纪常等，2003)、三疣梭子蟹(何伟贤，2004)等的死亡率极高的败血症与脓毒症，由于该细菌易产生抗药性的特点，目前还没有治疗这一严重疾病的理想方法，因此，创伤弧菌的快速检测将是促使人类健康和水产品健康养殖的关键。现有的创伤弧菌的检测手段主要有传统的分离培养与生化鉴定、ELISA技术、DNA杂交技术、分子探针杂交技术、普通双引物PCR技术等，这些方法有的具有费时费工和专业性要求高，有的具有操作难度大，有的具有敏感度低等缺点，很难在水产养殖过程中实际推广，已明显防碍了因创伤弧菌而引发的重大流行性疾病的防治。

半巢式PCR是通过3条特异性引物而实现的，其中一条为公用引物，另外两条分别为内外侧引物，这一方法明显提高了PCR检测技术的特异性，具有操作简单、灵敏度高、快速准确等优点，是国内外病害研究学者进行病原检测的首选方法，因此，该技术在细菌性病原的检测中已得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种可快速检测创伤弧菌的一管法半巢式PCR检测试剂盒，特别是提供3种创伤弧菌特异性引物Vvg1、Vvg2、Vvg3，并提供一种使用一管法半巢式PCR检测试剂盒检测创伤弧菌的方法。

本发明利用创伤弧菌gyrB基因的3个特异性位点而设计了半巢式PCR的3条寡聚核苷酸引物(Vvg1、Vvg2、Vvg3)，在高保真的PCR聚合酶系统中，首先用Vvg1和Vvg2进行扩增数个循环，可产生一定量的700bp的片段，然后再加入引物Vvg3，这时，两对引物(Vvg1和Vvg2、Vvg1和Vvg3)均可对自身的模板进行有效的扩增，但Vvg1和Vvg3这一对引物的扩增效率要大于前一对引物(Vvg1和Vvg2)的扩增效率，这样就确保了产物中700bp和350bp的2条片段的终产量基本相同，以此达到检测的高灵敏和高准确度。

本发明所采用的技术方案是：一种一管法半巢式PCR检测创伤弧菌的试剂盒，包括：

(1)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B；试剂A含有NaCl 200～350mmol/L，三羟甲基氨基甲烷50～100mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二钠50～100mmol/L；试剂B含有浓度为5～10％的十二烷基磺酸钠水溶液；

(2)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂C和反应引物试剂D和E；试剂C包括10×反应缓冲液5μL、500～1000μmol L^-1的dNTPs(四种脱氧核苷酸等浓度的混合物)、1～5m mol L^-1的MgCl₂，1～2个单位的热聚合酶和适量的灭菌超纯水；试剂D包括2种引物，浓度均为5～20μmol L^-1，这里的引物特指：

Vvgl(5’-CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC-3’)

Vvg2(5’-GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT-3’)

试剂E包括1种引物，其浓度为10～30μmol L^-1，这里的引物特指：

Vvg3(5’-AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT-3’)

(3)电泳和显色试剂，包括试剂F、试剂G、试剂H和试剂I；试剂F：为20-50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-醋酸和乙二胺四乙酸二钠，浓度分别为0.01～0.04mol/L和0.001mol/L；

试剂G：含0.1～0.5g琼脂糖；

试剂H：Nucleic acid ClearDNA stain

试剂I：标准分子量DL2000

使用上述一管法半巢式PCR检测创伤弧菌的试剂盒检测创伤弧菌的方法包括下列步骤：