[发明专利]检测乳腺癌特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于质谱检测技术领域，特别涉及对乳腺癌血液优化的质谱检测方法。一种通 过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测乳腺癌 生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域，为一种新的非侵入性的体外质谱 检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的乳腺癌生物标志组合的检测方法或 试剂盒。

背景技术

乳腺癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。基因组学研 究由于自身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用，而近年来蛋白质 组学的发展为人们从整体上了解恶性肿瘤的发生、发展提供了较为理想的技术平台。目前 临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志(tumor marker)，但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得到且重复 性差。乳腺癌在世界范围内其发病率都比较高，在美国每年的新发乳腺癌病人占女性各种 恶性肿瘤的1/3。在我国乳腺癌发病率也已居女性各种恶性肿瘤前列。虽然对于乳腺癌的 治疗已经取得了实质性的进展，预防和早期发现仍是降低乳腺癌死亡率的有效途径和提高 患者成活率的关键。但目前的检测方法敏感性和特异性均较低，已成为乳腺癌早期检测的 一个瓶颈。

乳腺癌的高发病率和高死亡率使得人们不断地寻求一种有效的早期检测方法，临床上 仅以CA153一种蛋白作为血清学检测指标在敏感性和特异性上是远远不足的，而影象学检 测一旦发现占位病变则已经不是很早期了。能够使疾病在发生的极早期就能够得已发现， 并得到控制和治疗，进而大大提高治愈率或明显改善病人的预后和生活质量。近年来随着 临床蛋白质组学的开展，使得乳腺癌的早期发现成为可能。

蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的 混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方 法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳 (two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)、高效液相层析(high-performance liquid chromatography，HPLC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)、亲和 层析(affinity choromatography)、蛋白芯片(protein microarray)、磁性微球(magnetic beads，简称磁珠)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术克服 了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等 特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织 液等；检测快速，一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅 约1小时。蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在生物标志 (biomarker)检测方面创造革命性突破(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床 医学中的研究进展，基础医学与临床，2007，27：134-142)。基质辅助激光解析/电离飞行 时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增强激光解析/电 离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。2-DE最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强 酸性和强硷性蛋白的分辩率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。近来，蛋 白芯片与质谱技术(SELDI-TOF-MS)的结合，已被成功地用于肿瘤研究；但由于磁珠表面 的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白 质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007，27：193-197)。磁珠具有优于 二维电泳、蛋白芯片和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤生物标志的筛查等研究 (屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临 床，2007)。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清、 尿液等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索 和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组 学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标志的筛查和临床检测，并均已获得很好的结果。 但国内迄今尚无采用磁珠与质谱技术获得检测乳腺癌血清特征蛋白的报道。