[发明专利]KNSL4的转移相关基因功能和预测乳腺癌患者预后的标志物用途及其应用方法

说明书

技术领域

本项目属于已知基因的新功能、新用途和应用方法的发明。具体讲是发现了已知基因KNSL4的转移相关基因功能，并可作为乳腺癌患者预后预测的基因标志；发明了基于KNSL4基因mRNA表达量预测乳腺癌患者预后的方法。

技术背景

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在欧美国家发病率高达10％，而低发的亚洲国家近年来发病人数和死亡人数呈显著的上升趋势，我国大城市中乳腺癌发病率已居女性恶性肿瘤的首位，成为妇女健康的重大威胁。乳腺癌是全身性疾病，肿瘤细胞的淋巴道和血道播散导致的全身转移是乳腺癌患者治疗失败和死亡的关键所在。乳腺癌转移相关基因的发现将为转移机制的研究提供线索，为转移的早期诊断提供分子标志，为患者的预后评估提供客观指征，为抗转移治疗提供基因靶点。

目前，关于驱动蛋白样DNA结合蛋白基因(kinesin-like DNA bindingprotein，KNSL4，kinesin-like 4，KIF22，Accession No.NM_007317)及其蛋白产物Kid的研究报道都是关于分子结构和基于分子结构的生物学功能的研究，已知该基因编码的Kid蛋白与微管结合驱动染色体的运动，在细胞有丝分裂中起关键作用。但KNSL4基因的改变对于细胞生物学行为的影响、与组织病理学改变的关系、基因表达量检测方法和应用的研究还是空白。

发明内容

为了筛选乳腺癌转移相关基因，采用Differential display RT-PCR(DDRT-PCR)方法，通过比较淋巴结转移阳性乳腺癌患者的原发癌和配对的淋巴结转移癌组织基因表达的差异和实时定量RT-PCR方法验证，发现了KNSL4的转移相关基因的新功能。

建立了定量RT-PCR检测KNSL4 mRNA表达量的方法；经大样本量的临床病例检测，发现KNSL4 mRNA水平与乳腺癌的多种临床病理因素及转移预后相关，与患者无转移生存期呈负相关(P＜0.05)，因此，KNSL4mRNA可作为乳腺癌患者预后预测的分子标志物；确定了基于KNSL4mRNA表达量可以区分预后好和预后差的患者群的临界值，高于临界值的患者判断判断为预后好，低于临界值的患者为预后差。

主要发明如下：

驱动蛋白样DNA结合蛋白(kinesin-like DNA binding protein，Kid，KIF22，Accession No.NP_015556)基因(kinesin-like 4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的转移相关基因功能。

KNSL4基因表达水平预测乳腺癌患者预后的标志物用途，基于KNSL4基因表达水平可以预测乳腺癌患者的预后，KNSL4表达水平高的患者预后好，表达水平低的患者预后差。

基于KNSL4基因表达水平预测乳腺癌患者预后的检测及应用方法，

a.提取肿瘤患者原发癌组织标本的细胞总RNA；以RNA为模板逆转录合成cDNA；以cDNA为模板，用KNSL4基因和管家基因的特异性引物和荧光标记探针进行实时定量PCR扩增，计算KNSL4基因mRNA的相对表达量为2^-ΔCt，其中，ΔCt＝Ct_KNSL4-Ct_GAPDH(C_T为实时定量PCR时荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数)；

b.根据乳腺癌患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的KNSL4 mRNA表达量，确定预后判断的临界值。KNSL4 mRNA表达量高于临界值的患者预后好，而低于临界值的患者预后差。

所述的检测方法，以原发癌组织中KNSL4 mRNA表达量为1.40×10^-3作为对肿瘤患者预后判断的临界值，高于该临界值的患者则判断为预后好，低于该临界值则判断为预后差。

所述的检测方法，

KNSL4基因实时定量RT-PCR的引物和探针序列是：上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特异性荧光标记探针序列：5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。

所述的检测方法，其荧光报告基团还可以是SYBR Green I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等荧光染料。

附图说明

附图是KNSL4 mRNA表达与患者生存期分析图。

具体实施方式

一、病例资料及标本取材

1.病例资料