[发明专利]适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系

权利要求书

1.一种适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系，其特征在于是由人原代肝细胞和筛选HGPRT阴性的HepG2作为亲本细胞，经融合杂交而得，该杂交细胞系继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能接种动物或传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养。

2.一种适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

a.对HepG2细胞进行诱导突变，并筛选HGPRT阴性的HepG2作亲本细胞；

b.分离培养人原代肝细胞作亲本细胞；所述的人原代肝细胞选自非HBV感染并且无其它嗜肝病毒感染，由肝脏手术获得的肝细胞；或者来自于年龄＜50岁、血清病毒HBV载量＞1.0×10⁷cp/ml的乙肝病毒感染但无其它嗜肝病毒感染的HBV感染者，通过肝活检获得的肝细胞；

c.将步骤b.分离培养的人原代肝细胞和步骤a.筛选的HGPRT阴性HepG2相融合，得合胞体细胞；对该合胞体细胞进行筛选，得杂交细胞。

3.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤c.所得杂交细胞在培养瓶中单层贴壁生长，细胞长椭圆形，传代一次3-5天。

4.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤a.中对HepG2细胞进行诱导突变是将HepG2细胞经0.3g/L乙基甲磺酸(EMS)诱导作用16小时，除去EMS，在DMEM培养基培养7-10天后加入6-巯基嘌呤(6-MP)使其终浓度为10mg/L，继续培养48小时。

5.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤b.的分离培养人原代肝细胞作亲本细胞，操作如下：

取肝脏手术病人，或HBV感染者肝脏穿刺检查而获得的肝组织少许，用含双抗(青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)的PBS缓冲液冲洗3-4次，将肝脏组织剪成小块，加入5ml0.01％的VI型胶原酶，37℃消化15min，将含胶原酶的上清液移入离心管中，重复进行一次，收集上清，将剩余组织块在200目铜网上研磨，培养基冲洗，收集上清，将所有上清一起离心，500rpm离心5min，重复3次，去除血细胞；用肝细胞培养液重悬离心所得沉淀采用差异贴壁法分离肝实质细胞与成纤维细胞，通过台盼兰染色排除法确定肝细胞存活率大于90％，备用。

6.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤c.中所述的融合是应用融合剂50％聚乙二醇实现人原代肝细胞与HGPRT^-HepG2的融合。

7.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，上述步骤c.的具体操作如下：

用胰酶消化法将HGPRT^-HepG2细胞和人原代肝细胞制成细胞悬液，计数板计数，将HGPRT^-HepG2细胞和分离得到的人原代肝细胞以20∶1的比例混合，离心去除血清，缓慢加入1ml50％PEG，进行融合作用1分钟，离心弃上清，用完全培养基重悬后移入培养板，24小时后加HAT选择培养基，2-3天换液一次，2周后利用有限稀释法将融合后细胞进行克隆，直至每孔含一个细胞，等细胞稳定生长后换HT选择培养基，1周后换用含10％胎牛血清的DMEM培养基维持培养；倒置显微镜下观察可见存活的融合细胞，所得杂交细胞形态学上与HepG2细胞相似；未杂交的细胞或HGPRT阴性的HepG2同核体融合细胞在HAT培养基中不能存活；未融合的或融合的同核体原代肝细胞则不能传代；只有异核体-杂交细胞才能存活。