[发明专利]适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系

说明书

技术领域

本发明涉及一种适应人乙肝病毒(HBV)自然感染和复制并可传代培养的杂交细胞系Hepatocyte hybrid line(简称为HepCHLine)及其制备方法，属于生命科学和医学中HBV细胞培养技术领域。

背景技术

乙型肝炎是我国的重要传染病之一。迄今对人乙肝病毒(HBV)病原学中HBV的早期感染和共价闭合环状DNA(cccDNA)的生成及调控机制尚不清楚。当前对HBV的认识大部分来自于其分子克隆，或其在外源性强启动子控制下部分基因的转染和表达；或鸭乙肝病毒(DHBV)感染原代鸭肝细胞的研究。这些技术手段和方法并不能满足对人HBV和其自然状态下感染宿主细胞研究的要求，因此当前对HBV的早期感染及cccDNA复制的有关认识是模糊的。然而明确这些认识对于揭示HBV的感染和复制规律甚为重要，对于乙型肝炎的防治具有重要意义。人原代肝细胞对HBV比较敏感，但是不能在体外长期传代培养；人肝肿瘤细胞能在体外长期培养但对HBV不敏感；外源性强启动子控制下部分HBV基因的转染和表达技术不能用于研究HBV自然状态下感染的过程；鉴于上述原因，需要一种既能对HBV敏感，又能在体外长期传代培养的细胞系，以满足对人HBV和其自然状态下感染宿主细胞研究的需要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种适应人乙肝病毒(HBV)自然感染和复制并可传代培养的杂交细胞系(Hepatocyte hybrid line，以下简称为HepCHLine)及其制备方法。本发明的技术任务如下：

(1)提供一种经人原代肝细胞和人肝胚瘤传代细胞(HepG2)融合杂交而产生的新生产物-杂交细胞系HepCHLine，它继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养；

(2)提供一种HepCHLine的制备方法；

(3)提供的HepCHLine可用于研究HBV自然感染和复制并可传代培养。

下面是本发明中使用的英文缩写说明：

HepCHLine：人原代肝细胞和人肝胚瘤传代细胞(HepG2)融合杂交而产生的杂交细胞系Hepatocyte hybrid line的英文简称。

HepG2：人肝胚瘤传代细胞。

HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。

HGPRT^-：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶阴性。

HGPRT^-HepG2：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶阴性的人肝胚瘤传代细胞。

HAT培养基：次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷培养基。

HT培养基：次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷培养基。

DMEM培养基：细胞基础培养基，可市场购买。

本发明的技术方案如下：

一、本发明的杂交细胞系

本发明的杂交细胞系HepCHLine是由人原代肝细胞和筛选HGPRT阴性的HepG2作为亲本细胞，经融合杂交而得，是一种全新的物质。HepCHLine继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能接种动物或传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养。

二、本发明的杂交细胞系HepCHLine的制备

一种适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，包括步骤如下：

a.对HepG2细胞进行诱导突变，并筛选HGPRT阴性的HepG2作亲本细胞；

b.分离培养人原代肝细胞作亲本细胞；所述的人原代肝细胞选自非HBV感染并且无其它嗜肝病毒感染，由肝脏手术获得的肝细胞；或者来自于年龄＜50岁、血清病毒HBV载量＞1.0×10⁷cp/ml的乙肝病毒感染但无其它嗜肝病毒感染的HBV感染者，通过肝活检获得的肝细胞。

c.将步骤b.分离培养的人原代肝细胞和步骤a.筛选的HGPRT阴性HepG2相融合，得合胞体细胞；对该合胞体细胞进行筛选，得杂交细胞。

上述杂交细胞可在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞长椭圆形，可传代培养，传代一次约需3-5天。可冻存，经冻存复苏后可继续生长。

下面是对杂交细胞的验证：

(1)对上述杂交细胞进行染色体核型分析、鉴定；

(2)检测不同代次HepCHLine中的HBV标志物HBsAg、HBeAg和HBV的rcDNA、cccDNA。