[发明专利]一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾－4－烯－3－酮中的应用

权利要求书

1.一株博德特氏菌，其特征在于：该菌命名为博德特氏菌(Bordetella sp.)B4，已于2007年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.2229。

2.如权利要求1所述的博德特氏菌，其特征在于：所述博德特氏菌(Bordetella sp.)B4为革兰氏阴性菌，单个细胞为球杆状，大小0.3um～0.7um×0.6um～1.1um，专性好氧；16srDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述博德特氏菌在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：应用中涉及的步骤顺序如下：

(1)菌种选择：选用博德特氏菌(Bordetella sp.)B4 CGMCC No.2229；

(2)斜面培养：将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.5～2.0％的琼脂，25～37℃条件下，静止培养24～72小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.01～1.0％的胆固醇的基本无机盐培养基中，25～37℃条件下，振荡培养24～72小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以体积比为1～10％的接种量，将种子液接种于50～1000mL含有质量体积比为0.1～1.0％的胆固醇的基本无机盐培养基中，25～37℃条件下，振荡培养48～144小时；

(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液在2000～8000rpm转速离心，分别收集上清液和沉淀，上清液即为胆固醇氧化酶粗酶液，沉淀为菌体和胆甾-4-烯-3-酮的混合物；

(6)胆固醇氧化酶的分离纯化：将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比为5～10％的硫酸铵和30～80％的硫酸铵，进行分级沉淀；收集沉淀物，用pH 7.0的磷酸缓冲液溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓缩至1～10ml，通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶；

(7)收集并分离胆甾-4-烯-3-酮：将步骤(5)中获得的沉淀用有机溶剂溶解；2000～8000rpm转速离心，上清液即为胆甾-4-烯-3-酮溶液；利用制备型TLC分离纯化，于真空干燥器中干燥，得到胆甾-4-烯-3-酮固体。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(2)、(3)、(4)中所述的培养温度是32～37℃，胆固醇的质量体积比为0.1％～1.0％。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(3)所述的菌体培养时间是48～72小时。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(4)所述的菌体振荡培养时间是60～120小时。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(5)、(7)中所述的离心机转速为5000～6000rpm。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(7)所述的有机溶剂为非极性的有机溶剂。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：步骤(7)所述的有机溶剂为三氯甲烷或乙酸乙酯。