[发明专利]一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用无效

专利信息
申请号: 200710114218.X 申请日: 2007-11-09
公开(公告)号: CN101182481A 公开(公告)日: 2008-05-21
发明(设计)人: 宋欣;林彦良;林建强;曲音波 申请(专利权)人: 山东大学
主分类号: C12N1/20 分类号: C12N1/20;C12N9/04;C12P7/26
代理公司: 济南金迪知识产权代理有限公司 代理人: 王绪银
地址: 250061山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一株博德特氏菌 及其 制备 胆固醇 氧化酶 中的 应用
【权利要求书】:

1.一株博德特氏菌,其特征在于:该菌命名为博德特氏菌(Bordetella sp.)B4,已于2007年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC No.2229。

2.如权利要求1所述的博德特氏菌,其特征在于:所述博德特氏菌(Bordetella sp.)B4为革兰氏阴性菌,单个细胞为球杆状,大小0.3um~0.7um×0.6um~1.1um,专性好氧;16srDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述博德特氏菌在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于:应用中涉及的步骤顺序如下:

(1)菌种选择:选用博德特氏菌(Bordetella sp.)B4 CGMCC No.2229;

(2)斜面培养:将菌种接种于基本无机盐培养基,其中添加质量体积比为1.5~2.0%的琼脂,25~37℃条件下,静止培养24~72小时;

(3)种子培养:将步骤(2)培养的菌株,在无菌条件下用接种环接1~2环于20~100mL含有质量体积比为0.01~1.0%的胆固醇的基本无机盐培养基中,25~37℃条件下,振荡培养24~72小时,制得种子液;

(4)扩大培养:以体积比为1~10%的接种量,将种子液接种于50~1000mL含有质量体积比为0.1~1.0%的胆固醇的基本无机盐培养基中,25~37℃条件下,振荡培养48~144小时;

(5)收集发酵产物:将步骤(4)所得的发酵液在2000~8000rpm转速离心,分别收集上清液和沉淀,上清液即为胆固醇氧化酶粗酶液,沉淀为菌体和胆甾-4-烯-3-酮的混合物;

(6)胆固醇氧化酶的分离纯化:将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比为5~10%的硫酸铵和30~80%的硫酸铵,进行分级沉淀;收集沉淀物,用pH 7.0的磷酸缓冲液溶解,利用透析的方法除去残余的硫酸铵;利用超滤的方法将发酵液浓缩至1~10ml,通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶;

(7)收集并分离胆甾-4-烯-3-酮:将步骤(5)中获得的沉淀用有机溶剂溶解;2000~8000rpm转速离心,上清液即为胆甾-4-烯-3-酮溶液;利用制备型TLC分离纯化,于真空干燥器中干燥,得到胆甾-4-烯-3-酮固体。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于:步骤(2)、(3)、(4)中所述的培养温度是32~37℃,胆固醇的质量体积比为0.1%~1.0%。

6.如权利要求4所述的应用,其特征在于:步骤(3)所述的菌体培养时间是48~72小时。

7.如权利要求4所述的应用,其特征在于:步骤(4)所述的菌体振荡培养时间是60~120小时。

8.如权利要求4所述的应用,其特征在于:步骤(5)、(7)中所述的离心机转速为5000~6000rpm。

9.如权利要求4所述的应用,其特征在于:步骤(7)所述的有机溶剂为非极性的有机溶剂。

10.如权利要求9所述的应用,其特征在于:步骤(7)所述的有机溶剂为三氯甲烷或乙酸乙酯。

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