[发明专利]一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾－4－烯－3－酮中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及到一株博德特氏菌及其应用，尤其涉及一株产胆固醇氧化酶的博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

背景技术

胆固醇是一种动物性甾醇，胆固醇的代谢异常会引起人体的许多疾病，例如动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、动脉瘤以及胆结石等疾病，因此，检测血浆和食品中的胆固醇以及降低食品中的胆固醇含量具有重要的临床意义，胆固醇氧化酶可以作为检测血浆中的胆固醇含量的重要工具；将胆固醇氧化酶添加到食品中可以降低食品中的胆固醇含量。此外，胆固醇氧化酶还可以抑制鳞翅目幼虫的生长。而且，胆固醇氧化酶可以把胆固醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮，胆甾-4-烯-3-酮是许多甾体类药物重要前体，在治疗肝病及抗肥胖等方面具有显著疗效。

胆固醇氧化酶可以作为一种重要的临床药物，并且能够进一步开发作为食品添加剂和作为农业杀虫剂，具有非常良好的市场前景。

目前，已报道的能够产胆固醇氧化酶的菌株主要有以下几个属：节杆菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、分支杆菌属、假单胞菌属、裂褶菌、短杆菌属、链霉菌属、红球菌属。但是，其胆固醇氧化酶的产率是非常低的，已经报导的菌株所产的胆固醇氧化酶酶活都处于比较低的水平。经检索，关于利用博德特氏菌属产胆固醇氧化酶并在胞外高表达的文献及专利还未见报道。

发明内容

针对目前胆固醇氧化酶产率低的问题和需要各种甾体类药物中间体以制备重要的甾体药物的现状，本发明要解决的问题是提供一株产胆固醇氧化酶的博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

本发明所述的博德特氏菌，其特征在于：该菌命名为博德特氏菌(Bordetella sp.)B4，已于2007年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCC No.2229。

上述博德特氏菌(Bordetella sp.)B4为革兰氏阴性菌，单个细胞为球杆状，大小0.3um～0.7um×0.6um～1.1um，专性好氧；16srDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，显示与博德特氏菌属的相似度达到99％。

本发明所述博德特氏菌在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

其中：应用中涉及的步骤顺序如下：

(1)菌种选择：选用博德特氏菌(Bordetella sp.)B4 CGMCC No.2229；

(2)斜面培养：将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.5～2.0％的琼脂，25～37℃条件下，静止培养24～72小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.01～1.0％的胆固醇的基本无机盐培养基中，25～37℃条件下，振荡培养24～72小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以体积比为1～10％的接种量，将种子液接种于50～1000mL含有质量体积比为0.1～1.0％的胆固醇的基本无机盐培养基中，25～37℃条件下，振荡培养48～144小时；

(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液在2000～8000rpm转速离心，分别收集上清液和沉淀，上清液即为胆固醇氧化酶粗酶液，沉淀为菌体和胆甾-4-烯-3-酮的混合物；

(6)胆固醇氧化酶的分离纯化：将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比为5～10％的硫酸铵和30～80％的硫酸铵，进行分级沉淀；收集沉淀物，用pH 7.0的磷酸缓冲液溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓缩至1～10ml，通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶；

(7)收集并分离胆甾-4-烯-3-酮：将步骤(5)中获得的沉淀用有机溶剂溶解；2000～8000rpm转速离心，上清液即为胆甾-4-烯-3-酮溶液；利用制备型TLC分离纯化，于真空干燥器中干燥，得到胆甾-4-烯-3-酮固体。

上述的应用中：步骤(2)、(3)、(4)中所述的培养温度优选是32～37℃，胆固醇的质量体积比优选为0.1％～1.0％。

上述的应用中：步骤(3)所述的菌体培养时间优选是48～72小时。

上述的应用中：步骤(4)中所述的接种量的体积比优选是3～7％，所述的菌体振荡培养时间优选是60～120小时。

上述的应用中：步骤(5)、(7)中所述的离心机转速优选为5000～6000rpm。

上述的应用中：步骤(7)所述的有机溶剂为非极性的有机溶剂。