[发明专利]一种将七叶苷用于高产β－葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选，尤其涉及一种将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法。

背景技术

在将天然纤维素水解为葡萄糖的过程中，必须依靠内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶三种酶的协同作用才能完成。其中β-葡萄糖苷酶是此过程的限速酶，其酶活的高低直接影响纤维素酶系的总体酶活的高低。目前应用最广的纤维素酶生产菌种大多是里氏木霉(Trichoderma reesei)的优良突变株。虽然这些菌株能产生高活力的内切及外切纤维素酶，但由于β-葡萄糖苷酶的活力很低，在利用纤维素酶水解纤维素的过程中，造成纤维二糖的积累，纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。因此，提高纤维素酶体系中β-葡萄糖苷酶的活力，是提高纤维素水解得率和葡萄糖产量的关键措施之一。对于β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选工作，传统的方法主要是在以纤维二糖为唯一碳源的平板上根据透明圈的大小进行筛选，由于纤维二糖价格较为昂贵，进行大规模筛选在经济上不太可行，另外通过透明圈分离的菌株产生的β-葡萄糖苷酶酶活的高低不好判断，通常还要逐一进行摇瓶发酵以进一步确定。

发明内容

针对目前β-葡萄糖苷酶筛选方法所用试剂较为昂贵和方法较繁琐等问题，以及在科研工作中急需快速简单的筛选方法的研究现状，本发明要解决的问题是提供一种将七叶苷用于β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法。

本发明所述将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法，步骤是从富含纤维素资源的地点(如：农田、森林、木材加工厂、农村秸杆堆集地、堆肥处)采集土样或挑选市售的微生物菌种，进行富集培养，将七叶苷加入基本无机盐培养基中制备平板并以其对富集液微生物进行初筛，以平板背面观菌落周围的培养基颜色变为黑色为指标选取目的菌株再进行摇瓶发酵复筛，通过DNS或Somogyi方法检测酶活性，筛选得到高产β-葡萄糖苷酶的微生物菌株；其特征在于：所述富集培养是以微晶纤维素或滤纸作为唯一碳源，在20～50℃、转速160～250r/min的条件下摇床培养12～72小时；所述对富集液微生物进行初筛的方法是将富集液进行10^-1～10^-7的梯度稀释，然后分别吸取0.1～0.3mL的稀释液均匀涂布到加入了质量体积百分比为0.01～3％七叶苷的基本无机盐培养基的平板上，在20～50℃下，培养12～72小时；所述选取目的菌株摇瓶发酵复筛的方法是挑取以平板背面观菌落周围的培养基颜色变为黑色的菌落接于产酶培养基中，在温度25～45℃、转速150～250r/min的条件下摇床培养1～7天，然后测酶活。

上述将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法中：所述土样的采集原则是含有产β-葡萄糖苷酶的细菌、真菌或放线菌；所述市售的微生物菌种是指能产β-葡萄糖苷酶的细菌、真菌或放线菌。

上述将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法中：所述富集培养的培养基配方(以质量体积百分比浓度计)如下：(NH₄)₂SO₄ 0.4％，Mg SO₄·7H₂O 0.05％，NaCl0.2％，CaCO₃0.4％，KH₂PO₄ 0.1％，七叶苷0.5％，链霉素适量。

上述将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法中：所述基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)的配方为：

每1000毫升蒸馏水中，以质量体积百分比浓度计，添加柠檬酸铁0.005～0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，琼脂0.5～4.0％。

其中：所述基本无机盐培养基的配方优选为：

每1000毫升蒸馏水中，以质量体积百分比浓度计，添加柠檬酸铁0.01～0.2％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，琼脂1.5～3.0％。

上述将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法中：所述向基本无机盐培养基平板中加入七叶苷的量优选是质量体积百分比0.1％～1.0％。

上述将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法中：所述富集培养的温度优选是25～45℃，培养时间优选是24～60小时。