[发明专利]耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法

权利要求书

1.一种耶尔森氏菌快速检测试剂盒，其特征是其中的试剂包括：

(1)环介导等温扩增反应液A：

包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol/L上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

其中所述的上游内引物5-CCGGTTTGATCGGTTTCGCCCACTTACAAGATGGGTGTGCC-3、下游内引物5-GTGCGTTTCTGGCCGAGCTTGCAGACGTTTTGCCAGGATT-3、上游外引物5-CGCCGTGAAGGTAAAGTTCA-3、下游外引物5-CAGAGTTCAGGAACGACAGC-3

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst DNA聚合酶B：8U/μL；

(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。

2.根据权利要求1中所述的耶尔森氏菌快速检测试剂盒，其特征是上述的混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

3.根据权利要求1中所述的耶尔森氏菌快速检测试剂盒，其特征是上述的环介导等温扩增反应液A每管23μL的组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物、1.0μL 20μmol/L下游内引物、0.25μL 20μmol/L上游外引物、0.25μL 20μmol/L下游外引物、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O。

4.一种耶尔森氏菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征是依次包括下列步骤：

(1)待检样品DNA的提取

A.取200mg待检样品或者1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；

B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；

C.加入100-150μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热10-15min；

D.然后用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取其上清液至一个1.5mL离心管中，即为待检样品模板DNA；

(2)进行耶尔森氏菌的环介导等温扩增反应：A.在装有23μL LAMP反应液A的反应管中加入1μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上50℃放置3min，然后在95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；

B.在上述反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶B；

C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90min；

D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5min后取出待检；

(3)显色检测

在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者不是耶尔森氏菌，如果颜色变为绿色，则说明样品为含有或者是耶尔森氏菌。