[发明专利]耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。

背景技术

耶尔森氏菌(Yersinia)又称巴斯德菌，系包括鼠疫菌的细菌的一属。可寄生于所有恒温动物，引起出血性败血症。革兰氏染色阴性，好氧性或兼厌氧性。对碳水化合物的发酵能力很弱，同时并不产生气体。耶尔森氏菌属包括11个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。该属细菌在病原寄主方面虽有明显特异性，但抗原的构成上却极为相似。又对噬菌体有相当高的感受性而导致溶菌。

鲁克氏耶尔森菌是引起春季传染性暴发鱼病的主要病菌。传染性暴发鱼病又称出血性败血症、溶血性腹水病、出血性腹水病等，它是上世纪末危害鱼类最严重的疾病之一。这种细菌对抗生素药物不敏感，防治较困难。其症状是：病鱼的上下颌、口腔、鳃盖、眼睛、鳍鱼体两侧轻度充血，此时肠内尚有少量食物；严重时鱼体表、眼眶周围、眼球充血，甚至出血，眼球突出、肛门红肿、腹部膨大、腹腔内积有淡黄透明腹水，鳃、肝、肾颜色均较淡，有的肝呈花斑状，病鱼严重贫血，肝、胆、脾、肾肿大，肠壁充血，有的病鱼鳞片竖起、肌肉充血、鳃丝末端腐烂。这类疾病对我国特别是北方的淡水鱼养殖业带来了巨大危害和经济损失。以往检测耶尔森氏菌的主要方法有三种：1.生理生化鉴定技术，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附试验，3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该方法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导等温扩增方法检测耶尔森氏菌的试剂盒及方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。

本发明涉及的耶尔森氏菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1)-(4)：

(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A：

包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁(MgSO₄)、0.8-1.2μmol/L上游引内物(FIP)、0.8-1.2μmol/L下有内引物(BIP)、0.2-0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2-0.3μmol/L下游内引物(B3)和1-1.5mol/L甜菜碱；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

其中所述的上游内引物5-ACCTGTGTTCCATGCTGCTTCTATTCGCAACTGACATGTCGG-3；

下游内引物5-TAACAAAGGTCACCGTCCAGGCCAGAACGCAGGTCTTGTGAA-3；

上游外引物5-CCAGAGCCAGAGTTCTTCCT-3；

下游外引物5-GGCCCATCTCTTCCATCAC-3。

其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO₄)、20mmol/L硫酸镁(MgSO₄)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst DNA聚合酶B：浓度为8U/μL；

(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNA Green。