[发明专利]利用细胞行为调控获取纤维堆囊菌液体发酵菌株的方法

权利要求书

1.一种利用细胞行为调控技术获取纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的方法，包括：

(1)纤维堆囊菌菌株胞外多糖分泌的减少或去除，

(2)纤维堆囊菌社会性细胞行为特征的去除，

(3)纤维堆囊菌液体分散生长的实现，

(4)生长迅速、代时减少的纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的获得；

其特征是：

步骤(1)所述的纤维堆囊菌菌株胞外多糖分泌的减少或去除是指：

进行纤维堆囊菌菌株连续液体传代培养时，在MML液体培养基中添加非离子型表面活性剂，浓度从0.05％依次递增到0.5％，每级梯度增加0.15％，在一个浓度条件下进行两次或两次以上的传代培养，逐级进行，最终实现纤维堆囊菌菌体液体培养时胞外粘液类物质的减少或去除；

步骤(2)所述的纤维堆囊菌社会性细胞行为特征的去除是指：

将获得的胞外多糖产生能力显著降低的菌株接种于10-20ml液体CDM培养基中，30℃，120转/分摇床培养至稳定期前期，然后加入100-200ml新鲜CDM培养基稀释菌体，取出10-20ml混合液继续30℃，120转/分摇床培养，每两天进行一次同样的稀释和再培养，重复50-100次，即获得社会性细胞行为特征去除的纤维堆囊菌；

步骤(3)所述的纤维堆囊菌液体分散生长的实现足指：

将获得的社会性细胞行为特征去除的菌体转入MML液体培养基摇瓶中，30℃，200rpm摇床培养至指数期，倒弃2/3～9/10的培养液，并用残留的液体冲刷菌体球，合并于灭菌的含玻璃珠及搅拌子的三角瓶内，置磁力搅拌器上打匀菌体，以1∶10的体积比例接种于新鲜的MML液体培养基中，30℃，200rpm摇床培养至指数期；重复这一过程，直至纤维堆囊菌菌株实现液体分散生长；

步骤(4)所述的生长迅速、代时减少的纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的获得是指：

通过步骤(1)至(3)的操作，获得无社会性细胞行为特征并且在液体中分散生长的纤维堆囊菌菌株，然后进行发酵条件优化，寻找此类菌株的适合培养条件，筛得优化的液体培养基，进而获得生长迅速、代时减少的纤维堆囊菌菌株，即为液体发酵的优良菌株。

2.如权利要求1所述利用细胞行为调控技术获取纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的方法，其特征在于：步骤(1)所述在液体培养基中添加非离子型表面活性剂是TritonX-100，或失水山梨醇单月桂酸酯类Span-20，Span-60，Span-40，Span-80，或聚环氧乙烷失水山梨醇单月桂酸酯类Tween-20，Tween-40，Tween 60，Tween-80中的一种，浓度以重量百分比计从0.05％依次递增到0.5％，每级梯度增加0.15％，在一个浓度条件下进行两次或两次以上的传代培养，逐级进行，最终实现减少或去除纤维堆囊菌菌株胞外多糖的分泌。

3.如权利要求1所述利用细胞行为调控技术获取纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的方法，其特征在于：步骤(2)所述CDM培养基的成分以重量百分比计为：脱脂奶粉0.05-0.1％，酵母粉0.05-0.1％，马铃薯淀粉0.5-1.0％，甘油0.1-0.2％，CaCl₂·2H₂O 0.05-0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05-0.15％，Fe-EDTA 6-10mg/L，HEPES 30-60mmol/L，pH 7.0-7.3。

4.如权利要求1所述的一种利用细胞行为调控技术获取纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的方法，其特征在于：步骤(1)或(3)所述MML液体发酵培养基的成分为：地瓜淀粉15～35g/L，水解乳蛋白8～20g/L，CaCl₂·2H₂O 0.8～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L。

5.如权利要求1所述的一种利用细胞行为调控技术获取纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的方法，其特征在于：步骤(4)所述获得的液体发酵菌株在液体培养时能够分散生长，代时能由野生型的12-16小时缩短到4-5小时。