[发明专利]利用细胞行为调控获取纤维堆囊菌液体发酵菌株的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及粘细菌液体发酵菌种改造的工艺方法，具体地说涉及一种利用细胞行为调控技术获取粘细菌纤维堆囊菌液体发酵优良菌株的方法。

(二)背景技术

粘细菌(myxobacteria)是一类可滑动的单细胞革兰氏阴性细菌，在其整个生活史中表现出复杂的多细胞行为特征，如细胞的生长依赖于细胞的密度(cell-densitydependent growth)，细胞的运动同时存在个体运动(adventurous motility)和群体运动(social motility)方式，细胞菌落按节律方式扩展，以及在固体介质表面营养饥饿的高密度细胞聚集并分化发育形成复杂的多细胞休眠性子实体(fruiting body)结构等。

粘细菌是典型的化能有机营养菌，严格好氧，其生长发育一般分为两个阶段：第一个阶段是营养细胞生长期，细胞在适宜生长的培养基上经过一个潜伏期后能够以指数形式生长，生长速率极慢，代时一般为4～12小时，而其中最具应用价值的纤维堆囊菌的代时可以长达16小时。营养细胞的生长停止后进入生活周期的第二阶段，即细胞发育期。在生长过程中，粘细菌细胞的生长依赖于细胞的密度，即在利用蛋白质等大分子底物生长时，粘细菌的初始细胞浓度必须达到一定的阈值，否则细胞不能生长，这与粘细菌通过子实体由大量的由粘孢子生成的细胞开始一个新生活循环的特征相对应。比从单个细胞生长和形成孢子从进化上是一个更好的生存选择，对种群的延续也更为有利。

作为最高等的原核生物，粘细菌特殊的社会性细胞行为和多细胞形态发生在进化上不仅高于一般原核生物，而且与真核生物有着极大的相似性，被认为是原核生物和真核生物间界面上的微生物类群，是研究生物进化和细胞自组织的重要材料。

近年来，粘细菌尤其是其中的纤维堆囊菌(Sorangium celluloslum)由于丰富多样的活性次级代谢产物产生能力而引起医药工业领域的广泛关注。在原核生物中按已发现生物活性物质的数量，粘细菌仅排在放线菌和芽孢杆菌之后，尽管粘细菌次级代谢产物的研究历史比它们短的多。目前，已从粘细菌中发现100多种的基本结构和600多种结构衍生物。粘细菌中分离的天然产物大多数来源于纤维堆囊菌属，粘球菌属，软骨霉状菌属和标桩菌属；而小囊菌属和珊瑚球菌属中能检测到的天然产物非常有限。其中来源于纤维堆囊菌的天然产物几乎占了所检测的粘细菌来源的天然产物的一半，并且几乎100％的纤维堆囊菌菌株都能够产生生物学活性次级代谢产物，其代谢产物的化学结构和生物活性作用机制的多样性甚至可以与著名的链霉菌类群相比拟。

促微管聚合类化合物紫杉醇(Paclitaxel，Taxol^)及其类似物Docetaxel(Taxotere^)是目前临床上最为成功的抗肿瘤化疗药物，被用于卵巢癌、胸腺癌、结肠癌、肺癌和肝癌等实体癌的治疗，是美国FDA认定的实体瘤化疗的首选药物。在与紫杉醇具有相同或相似生物学功能的五种天然化合物中，只有埃博霉素(Epothilones)来源于微生物纤维堆囊菌的发酵产物，并被认为是紫杉醇的更新换代产品，是更好的抗癌药物。目前，已有多个埃博霉素类化合物进入了不同阶段的临床试验。

因此，关于粘细菌尤其是纤维堆囊菌工业化液体发酵的相关研究和技术具备了很好的应用前景和意义。但是，作为细菌中的特例，纤维堆囊菌的细胞行为特性使得利用其进行液体发酵生产次级代谢物，仍面临着许多亟待解决的问题。纤维堆囊菌的代时通常远远大于普通细菌，因此发酵周期较长，在液态培养时容易造成染菌，例如埃博霉素发酵的周期通常在14天左右；野生纤维堆囊菌次级代谢产物的产量比较低；纤维堆囊菌具有的细胞密度依赖性和大量分泌胞外粘液的特性使其在液体表面形成菌膜或沿着器具内壁蔓延，在液体内部易形成团块和面条状菌团，难以分散生长；菌团内外的细胞状态不一致，导致总体性发酵调控十分困难；而且，纤维堆囊菌次级代谢产物有时只有在发酵过程中施加限制条件才能产生。

为了实现纤维堆囊菌优良液体发酵菌株的选育，采取细胞行为调控的方法，驯化菌株，调控发酵过程显得合理和可行。经过文献和专利的检索，国内外针对上述问题的相关技术和方法至今未见文献或专利报道。

(三)发明内容

针对上述粘细菌纤维堆囊菌液体发酵生产各种代谢产物过程中，发酵菌株表现出的不足，本发明的主要目的是提供一种以细胞行为调控技术为基础的发酵菌株选育和改造流程，它可以有效地克服现有工艺的缺陷，更加高效和针对性地获得优良的纤维堆囊菌液体发酵菌株。