[发明专利]一种转化烟曲霉的方法及其专用表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种转化烟曲霉的方法及其专用表达载体。

背景技术

侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis，IA)IA主要由烟曲霉感染引起。近年来，IA的发生呈现出上升趋势，而且病情十分严重，在白血病和骨髓移植受者等重症免疫受损(immunocompromised)机体中IA的死亡率常超过90％，已经成为这群患者发生死亡的主要原因之一。

要明确侵袭性曲霉病发病机制，首先要了解烟曲霉的基因功能，基因的功能决定了该菌的致病性、发病机制、耐药性等性状。烟曲霉基因组测序工作已于2005年底结束，这使得对烟曲霉基因功能的研究速度加快。

基因敲除是研究基因功能的一种重要的手段。基因敲除(gene knockout)是利用细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，通过同源重组使特定基因失活，以研究该基因的功能；基因敲除的生物学原理是DNA同源重组。基因敲除工作中最重要的一步是将带有筛选标记的外源DNA转化到烟曲霉细胞内，使其与宿主细胞染色体DNA发生同源重组。然而现有的曲霉基因敲除时的转化方法均存在转化的同源重组率低或转化效率低的问题，这严重阻碍了烟曲霉基因功能研究的进程。

目前，曲霉基因敲除时的转化方法有①原生质体方法(protoplast)。通过制备原生质体来转化烟曲霉是最常用的方法，这种方法工作量大、消耗时间多，而且同源重组率非常低，通常1μgDNA转化后能得到1-100个转化子。②电转化法(electroporation)。与原生质体方法相比，优点是比原生质体法得到的转化子多2-10倍；但这些方法的非同源重组率高、多位点重组现象高，同源重组率更低。以上两种方法得到的转化子中发生单位点同源重组的几率＜1-3％，这就意味着转化后的筛选工作量非常繁重。③农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciens-mediatedtrasformation，ATMT)。农杆菌介导的转化已在植物基因工程中广泛应用。农杆菌内Ti质粒(双元载体)上含有T-DNA(transferred DNA)，T-DNA能被转移到植物细胞并整合到其染色体上。利用农杆菌和双元载体的这些生物学特性，把任意外源性DNA插入到T-DNA区，该外源DNA也能转化到植物细胞内并与其染色体整合。后来的研究发现，农杆菌不但能介导植物细胞转化，而且还能介导真菌、哺乳动物细胞等的转化。作为一种新的转化方法，农杆菌介导的转化已成功用于曲霉属的一些真菌的转化，如烟曲霉、土曲霉、A.awamori，A.giganteus等。农杆菌介导的转化得到的转化子多数为单拷贝的同源重组。

目前，农杆菌介导的真菌转化中，学者们使用的筛选标记是显性标记潮霉素磷酸转移酶(hph)基因。潮霉素抑制真菌蛋白合成。野生株烟曲霉对潮霉素敏感，所以在含有该药的培养基上筛选转化子。使用这种筛选标记的缺点是：筛选转化子的培养基上要加潮霉素；转化和筛选过程是分开的，而且需要两种培养基：基础培养基和筛选培养基；转化过程中还需要尼龙膜；另外，在根癌农杆菌介导的一种人类致病真菌——组织胞浆菌的实验中发现，得到的转化子中有的是假性克隆(Sullivan TD，Rooney PJ，Klein BS.Agrobacterium tumefaciens integrates transfer DNA into singlechromosomal sites of dimorphic fungi and yields homokaryotic progeny frommultinucleate yeast.Eukaryot Cell.2002，1(6)：895-905.)，原因是在含潮霉素的筛选培养基上，部分烟曲霉会被诱导产生耐药，形成假性克隆。

嘧啶是真菌生命必需的物质。乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(orotidine-5’-monophosphate decarboxylase，pyrG)基因是真菌嘧啶生物合成必需的基因，pyrG基因功能缺失株烟曲霉在不含尿嘧啶和尿苷的培养基上不能生长。

发明内容

本发明的目的是提供一种转化烟曲霉的方法及其专用表达载体。

本发明所提供的表达载体，是在Ti质粒的多克隆位点插入pyrG基因得到的重组表达质粒。

其中，所述Ti质粒可为现有的双元载体，或按照现有方法制备的双元载体，如图1所示的pDHt/sk。