[发明专利]耐高温木聚糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

权利要求书

1.一种表达耐高温木聚糖酶的工程菌，其是将质粒图谱如附图 2所示的表达载体pKLAC1-mxynB₍₆₄₎通过电转化导入乳酸克鲁维酵母 GG799中得到的，包括以下步骤：

（1）挑取新鲜的单菌落于5ml组成为酵母粉1％，蛋白胨2％， 葡萄糖2％的YPD液体培养基中，于30℃，250rpm过夜培养；

（2）在室温下以体积比0.1％的接种量接种于100ml新鲜配制的 YPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养至OD₆₀₀为0.4～0.5；

（3）在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；

（4）用250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞一次；

（5）用50ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB洗涤细胞一次；1L 缓冲液EB中含蔗糖92.4g，氯化镁2.03g，10mmol/L pH7.5的MES 缓冲液1L；

（6）将细胞重悬于50ml冰预冷的无菌预处理缓冲液，于30℃ 静止，培养30分钟；

（7）在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；

（8）用10ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB洗涤细胞一次；

（9）用200μl冰预冷的电转化缓冲液EB重悬细胞，以每管50μl 分装于小管；

（10）向每管中加入2μl线性化的表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎， 混匀，冰上放置15分钟；

（11）将混合了DNA的感受态细胞转入0.2cm的电转杯；

（12）在Gene-Pulser电转仪上，在1000V，400Ω，25μF条件下 电击细胞；

（13）马上加入1ml冰预冷的YPD液体培养基于经转化的细胞 中，混匀后转入1.5ml离心管；

（14）用1ml无菌水洗涤细胞2次；

（15）将细胞用无菌水稀释1000倍，涂布含5mM乙酰胺的酵 母基本碳源培养基YCB，30℃培养3~5天挑选较大的菌落作为阳性 转化子；所述含5mM乙酰胺的酵母基本碳源培养基YCB其1L配方 为：1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液30ml,YCB培养基粉末11.7g,琼 脂20g,乙酰胺0.3g；

所述表达载体pKLAC1-mxynB₍₆₄₎是通过以下步骤得到的：

1）采用PX1、PX2引物，提取海栖热袍菌（Thermotoga maritima）， MSB8的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增耐高温木聚糖酶基 因mxynB₍₆₄₎；所述PX 1引物为：5’–CCCctcgagAAAAGAATGAAA  ATATTACCTTC-3’；所述PX2引物为5’–TTTggtaccTCATTTTCTT  TCTTCTATCTTTTTCT-3’，小写部分分别为XhoI和KpnI酶切位点；

2）回收PCR产物，将其连接到载体pMD18-T-Simple上；

3）用限制性内切酶XhoI和KpnI分别对pMD18-T-xynB₍₆₄₎和 pKLAC1进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其 连接，得到表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎。

2.一种表达耐高温木聚糖酶的方法，其包括以下步骤：培养权 利要求1所述工程菌，并诱导耐高温木聚糖酶的表达；培养时所用的 YPG培养基组成为：酵母粉1%，蛋白胨2%，半乳糖2%;培养条件 为30℃，初始pH为7，250rpm，培养36-72小时后诱导耐高温木聚 糖酶的表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导条件为每24 小时补充一次诱导物半乳糖，每次补充半乳糖至终浓度为2%。