[发明专利]耐高温木聚糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及来自真细菌耐高温木聚糖 酶基因在乳酸克鲁维酵母中的分泌表达。

背景技术

木聚糖酶主要由腐生真菌和细菌产生，它能降解植物细胞壁中的 木聚糖成分，并被证实在农业和工业的多个领域都具有重要的应用价 值。木聚糖具有异源性，因而完全降解木聚糖需要多种酶的共同作用， 其中β-1，4-D-木聚糖酶是其中一种关键酶，它能打断主链上D-木糖残 基之间的β-1，4糖苷键，从而把多糖的骨架降解成短链的木寡糖。因 此β-1，4-D-木聚糖酶在食品，饲料和造纸工业中有着非常广泛的应用。 其中，耐高温木聚糖酶XynB属于β-1，4-D-木聚糖酶中的一种，耐高 温木聚糖酶XynB的编码基因是mxynB₍₆₄₎，其GenBank登录号为 AY340789，该基因克隆自一种耐热真细菌-海栖热胞菌(Thermotoga maritima，MSB8)，该酶的最适反应温度为90℃，最适反应pH值 为6.2，且在碱性条件下稳定，因此在工业上，特别是在纸浆漂白工 艺上具有巨大的应用价值(参见Winterhalter C，Liebl W.Two extremely thermostable xylanases of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima MSB8.Applied and Environmental Microbiology， 1995，61(5)：1810～1815)。

目前，已有在大肠杆菌中表达来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8木聚糖酶基因mxynB的报道，虽然目的基因表达量 高，但产物主要集中在细胞内，使得后续的分离纯化成本增高。本发 明构建了木聚糖酶的乳酸克鲁维酵母表达载体，使得表达产物大部 分分泌至胞外，有效解决了上述问题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种可在乳酸克鲁维酵母中表达木聚糖酶 基因的表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培养条件简单，发酵时间短的表 达耐高温木聚糖酶的方法。

(二)技术方案

本发明提供了一种耐高温木聚糖酶的表达载体pKLAC1-mxynB₍₆₄₎， 它是将耐高温木聚糖酶基因mxynB₍₆₄₎插入到表达载体pKLAC1上构 建得到的，其质粒图谱如附图2所示。

应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的条件 下，可以对pKLAC1-mxynB₍₆₄₎的核苷酸序列进行修改，同时可以对 pKLAC1的非必需区段进行替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸， 另外还可以对例如多克隆位点进行修改，然而这些修改并没有改变本 发明的实质，均属于本发明的范围。

本发明还提供了一种耐高温木聚糖酶的表达方法，其包括以下步 骤：

1)将上述表达载体导入乳酸克鲁维酵母中，筛选得到表达耐高温 木聚糖酶的工程菌；

2)培养所述工程菌，并诱导耐高温木聚糖酶的表达。

所述培养条件为30℃，初始pH为7，250rpm，培养36-72小时 后可诱导耐高温木聚糖酶的表达。所述诱导条件为每24小时补充一 次诱导物半乳糖，  每次补充半乳糖至终浓度为2％。

其中，培养时所用的YPG培养基组成为(w/v)：酵母粉1％，蛋 白胨2％，半乳糖2％。

采用本发明所述的方法，摇瓶培养48小时，细胞密度达OD₆₀₀为 20，胞外分泌酶量可达70mg/L，以Remazol Brilliant R-D-Xylan[(简 称：RBB-Xylan)，中文名称为：4-氧甲基-D-葡萄糖苷-D-木聚糖 -Remazol-亮蓝R]为底物，酶活为6105U/L。

(三)有益效果