[发明专利]一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用

权利要求书

1.一种高效表达腈水合酶基因工程菌的构建方法，按照如下步骤进行：

(1)根据目的启动子基因的DNA序列设计引物，以含有目的启动子基因的DNA为模板进行PCR方法扩增，得到启动子基因；  

(2)将启动子基因与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14～16h，得连接反应物；

(3)将连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布LB平板(kan+)，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因的诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒；

(4)根据腈水合酶基因序列设计上、下游引物，并以具有原始腈水合酶基因的诺卡氏菌Nocardia YS-2002的总DNA为模板进行PCR扩增，得腈水合酶的DNA序列；然后用EcoRI和BamHI进行双酶切，再用T4连接酶将腈水合酶DNA序列插入大肠杆菌质粒pET28，获得重组质粒pET28-NHase；再用试剂盒定点突变方法将腈水合酶基因的α亚基起始密码子gtg突变为atg，获得突变腈水合酶基因NHase^M；

(5)以步骤(4)获得的突变腈水合酶基因NHase^M的DNA序列为模板进行PCR扩增，获得突变腈水合酶基因NHase^M的DNA序列，然后用BamHI和HindIII对突变腈水合酶基因NHase^M与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14-16h，得连接反应物；

(6)将步骤(5)连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，然后涂布在LB平板(Kan+)培养基上，挑选阳性克隆，并在LB培养基中37℃过夜培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因及突变腈水合酶基因NHase^M的穿梭质粒；

(7)将步骤(6)所得穿梭质粒以电穿孔转化法转化宿主细胞，即获得具有目的启动子基因和突变腈水合酶基因NHase^M的基因工程菌。

2.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于步骤(1)中所述的目的启动子基因为酰胺酶启动子基因或大肠杆菌tac启动子基因。

3.按照权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述的大肠杆菌tac启动子基因，其-35区和-10区序列分别为：TTGACA和TATAAT。

4.按照权利要求1、2或3所述的构建方法，其特征在于步骤(4)中所述的腈水合酶基因为来自诺卡氏菌的腈水合酶基因或经过突变、重排、缺失等方法获得的与来自诺卡氏菌的腈水合酶基因的DNA序列一致性大于等于70％、蛋白质序列一致性大于等于70％的同源基因。

5.按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述的突变腈水合酶基因是α亚基起始密码子gtg突变为atg的腈水合酶基因。

6.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于步骤(3)中所述的穿梭质粒为带有酰胺酶启动子基因或tac启动子基因的pNV18质粒或pNV18衍生质粒。

7.按照权利要求6所述的构建方法，其特征在于步骤(6)中所述的穿梭质粒为带有酰胺酶启动子基因或tac启动子基因和突变腈水合酶基因NHase^M的pNV18质粒或pNV18衍生质粒。

8.按照权利要求7所述的构建方法，其特征在于步骤(6)中所述的宿主为诺卡氏菌或紫红红球菌。

9.利用上述权利要求1～8任一所述的构建方法所得的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于携带tac启动子基因或酰胺酶启动子基因和突变腈水合酶基因NHase^M。

10.按照权利要求9所述的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于所述的菌株是诺卡氏菌TH-1，保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物保藏中心，保藏登记号为CGMCC No.2104。

11.按照权利要求9所述的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于所述的菌株是紫红红球菌TH-2，保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物保藏中心，保藏登记号为CGMCC No.2105。