[发明专利]一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体地说涉及一种利用诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒构建高效表达腈水合酶基因工程菌的方法以及所得到的基因工程菌株和应用。

背景技术

利用丙烯酰胺(Acrylamide，分子式为C₃H₅NO，结构式为H₂C＝CHCONH₂)合成的各种类型的聚丙烯酰胺(PAM)在三次采油、水处理、造纸、采矿、冶金、洗煤和制造高吸水性树脂等工业生产中具有非常广泛的应用。

丙烯酰胺的生产一般是以丙烯腈为原料，进行催化水合而成。丙烯酰胺的生产经历了硫酸水合法、铜催化法、微生物法三个发展阶段。由于微生物法具有反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等优点，与其他方法相比，微生物法具有明显的优势。

在利用微生物法的最初阶段，主要是筛选和驯化具有腈水合酶活性的菌株。在微生物方面的主要进展有：日本，山田秀明研究组在专利《生物学生产酰胺的方法》(专利号：ZL88106735))公开了一种野生玫瑰色红球菌J-1，日本化学工业株式会社在专利《利用微生物制备酰胺的方法》(专利号：ZL86100062)公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌，英国西巴特殊化学水处理有限公司在专利《紫红红球菌菌株NCIMB 41164及其生产腈水合酶的用途》(申请号：200480035487.1)中公开了一种了紫红红球菌NCIMB 41164菌株或其突变体，美国亚什兰许可和知识产权有限公司在专利《腈水合酶生产菌株紫红红球菌M33的培养方法》(申请号：200480043243.8)”中公开了一种紫红红球菌M33，上海市农药所在专利《微生物催化法生产丙烯酰胺》(申请号：03115536.7)中公开了野生丙酸棒杆菌及其驯化菌株等不同的微生物进行丙烯酰胺的微生物法生产。在生产方法方面，清华大学化工系公开了《一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法》(专利号：ZL 03109806.1)，《提高腈水合酶产物耐受性的定向培育法》(专利号：ZL 03130658.6)和《葡萄糖-Co²⁺耦合补加发酵制备腈水合酶的工艺方法》(专利号：ZL 03121944.6)；河南焦作多生多化工股份有限公司公开了《微生物凝聚法生产丙烯酰胺的方法》(申请号：200410010364.4)；德国施托克豪森公司公开了《用一种生物催化剂制备一种丙烯酰胺水溶液的方法》(申请号：02808905.7)；《傅里叶变换红外在线测量丙烯腈和丙烯酰胺》等等。在转化丙烯腈生产丙烯酰胺的基因研究方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号：ZL99106291.4)；《新型腈水合酶》(专利号：02156180.X)，并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》(申请号：200580008206.8)；日本三菱丽阳株式会社公开了《改良型腈水合酶》(申请号：200580016665.0)，提供了对腈水合酶基因进行定点突变来提高耐热性的方法；清华大学从诺卡氏菌中克隆获得了腈水合酶基因并申请了专利《一种腈水合酶及其编码基因与应用》(专利号：ZL 200410042576.0)，进一步对该基因在重组大肠杆菌中的突变和高表达进行了研究。

诺卡氏菌和红球菌属于革兰氏阳性菌株，具有比较厚的细胞壁。同时，作为腈代谢酶系的天然表达菌株，诺卡氏菌和红球菌中还可能存在某些分子伴侣，或良好的氧化还原环境，使得胞内表达的腈水合酶与重组大肠杆菌相比，具有更高的热稳定性和底物、产物耐受性。为此，采用诺卡氏菌和红球菌宿主进行腈水合酶基因的过表达在工业生产中具有更广阔的前景。

发明内容

本发明目的之一是提供一种高效表达腈水合酶的基因工程菌的构建方法。

本发明目的之二是提供高效表达腈水合酶的基因工程菌株。

本发明目的之三是提供利用腈水合酶基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法。