[发明专利]重组人源过氧化氢酶的制备方法及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种制备人源过氧化氢酶的方法。具体而言，本发明提供了一种采用基因工程技术克隆人源过氧化氢酶基因，构建其表达质粒，转化细胞获得高产量人源过氧化氢酶的方法。

技术背景：

过氧化氢酶是一类在自然界需氧生物体内分布很广泛的酶，能高效的催化过氧化氢生成分子氧和水。机体细胞呼吸过程中部分氧会被还原为H₂O₂，H₂O₂易被细胞内还原剂还原为体内最强的一种氧化剂·OH自由基，体内也可通过Fenton反应和HarbeWeiss反应产生。在病理情况下，H₂O₂累积，会造成过多·OH，产生严重的氧化损伤，过氧化氢酶能消除由机体代谢过程中产生的H₂O₂，阻断·OH的累积，达到防止氧化损伤的作用。

自由基病理学的研究，发现了活性氧与许多人类疾病日益密切的联系，因此研究如何清除活性氧成为一个热点。从机体自身的角度讲，主要有机体抗氧化酶、脂溶性抗氧化剂、水溶性小分子抗氧化剂、蛋白抗氧化剂等组成了机体抗抗氧化防御系统。作为抗氧化酶体系之一的过氧化氢酶受到更大关注。

近年来，国外有关治疗性应用过氧化氢酶的研究报道逐步增加。例如Ashok Gupta等人报道了过氧化氢酶能有效地减少肿瘤发生的细胞模型。有人用脂质体包埋的SOD和CAT通过静脉注射的方式，使暴露于100％氧气中的小鼠存活率明显上升。RoscoeL.Warner等人用免疫复合物诱导急性肺损伤的大鼠模型，注射牛肝过氧化氢酶，可以明显地减少炎症反应中嗜中性白血球及减轻肺泡的损伤。另外Joachim Ruh等人用非类固醇类消炎剂吲哚美辛诱导炎性肠胃道疾病的大鼠模型，静脉注射过氧化氢酶，可以很明显的减轻炎症区域的充血情况和减少了小动脉的血管直径，起到抗炎作用等。在国内有人用CAT和SOD联合用药，对眼前段碱烧伤的治疗作了一定的探索。

国外Holly等研究者曾测定长寿命的转基因鼠(the armes dwarf mouse-singlepoint mutation in Prophet of pit-1 gene)和同胞鼠体内各器官内Catalase表达水平，结果转基因鼠在不同生长时间、在肝脏、肾、心脏内Catalase含量明显高于对照鼠。国内也有通过调节过氧化氢酶水平，达到抗衰老目的相关报道。这些实验报道给我们启示了过氧化氢酶可延缓机体衰老，可能有临床使用的可能性。

但是，目前的研究试验所采用的基本上都为牛肝过氧化氢酶，或者是采用基因工程表达的微生物来源的过氧化氢酶，尚未发现用人源过氧化氢酶通过外源性给药的方式进行临床用途的试验的报道。为了解决基因同源性，避免外源蛋白引起的免疫反应问题，必须采用人源过氧化氢酶和解决人源过氧化氢酶来源的问题，

目前有研究拟从人组织中提取获得过氧化氢酶，但是由于来源受到限制以及疾病源污染的问题，不能符合临床上的广泛用途。目前也尚见人源的过氧化氢酶在细菌，酵母，昆虫等表达系统表达制备的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备重组人源过氧化氢酶的方法。

本发明利用基因工程的手段制备重组人源过氧化氢酶。本发明所制备的人源过氧化氢酶产量高，高活性，生产方法简便，无疾病源污染的问题。

本发明进一步目的是提供本方法制得的重组人源过氧化氢酶在抗氧化抗衰老中的用途。

本发明提供的利用基因工程技术制备人源的过氧化氢酶的方法，其包含下述步骤：

(1)将可编码人源过氧化氢酶的基因嵌入含适当转录启动子的表达载体中构建重组质粒；

(2)将该重组质粒转化到适当的宿主细胞中；

(3)于适合该细胞表达过氧化氢酶的条件下培养该转化细胞；

(4)纯化所表达的人源过氧化氢酶。

基于人所有组织的过氧化氢酶基因均具有一致的基因同源性，本发明的方法除可以生产人胚胎肝细胞来源的过氧化氢酶外，还适用于人组织和血浆来源的所有过氧化氢酶。

本发明方法以基因库中的人源过氧化氢酶基因的DNA序列为基础设计引物，PCR扩增各种人组织来源的过氧化氢酶基因，构建表达载体，转化宿主细胞，并令其表达而制得。

扩增的人源过氧化氢酶基因以公知的方法插入表达载体中，包括任何可用于细菌，酵母，昆虫表达系统的表达载体。例如PBR，PUC，PET，pPIC等载体，可根据需要选用。