[发明专利]在酵母中生产L－乳酸的方法与材料

权利要求书

1.一种用于转化酵母种的细胞之重组核酸，其包含与LDH基因上游和下游侧翼序列共价连接的对于该酵母种而言外源的LDH基因，该侧翼序列分别与对于该酵母种天然的靶基因的上游和下游侧翼序列同源，并且含有至少一个选择性标记。

2.权利要求1的重组核酸，其中所述LDH基因上游的侧翼序列包括与靶基因启动子序列同源的启动子序列，该LDH基因下游的侧翼序列包括靶基因的终止序列。

3.权利要求2的重组核酸，其中所述选择性标记与启动子和终止序列有效连接。

4.权利要求2的重组核酸，其中所述靶基因是PDC基因。

5.权利要求3的重组核酸，其中所述选择性标记不打断上游侧翼序列、LDH基因和下游侧翼序列的序列。

6.权利要求1的重组核酸，其中所述外源乳酸脱氢酶基因来自于瑞士乳杆菌(L.helveticus)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。

7.酵母种的一种重组细胞，其中该酵母种在其基因组的基因座内含有靶基因，该细胞具有整合到其基因组内的外源乳酸脱氢酶基因，其处于靶基因的启动子和终止序列的功能部分的转录控制之下，LDH基因在靶基因的基因座处整合，而该靶基因被从细胞基因组中删除。

8.权利要求7的细胞，其中靶基因是丙酮酸脱羧酶基因。

9.权利要求7的细胞，它是酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或Yamadazyma之一的一个种。

10.权利要求9的细胞，其中所述酵母种是马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、乳酸克鲁维酵母(K.lactics)或C.sonorensis。

11.权利要求8的细胞，其中乳酸脱氢酶基因来源于瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌。

12.一种将外源乳酸脱氢酶基因整合到细胞内的方法，其中在整合之前，该细胞在其基因组的基因座处含有一个靶基因，该方法包括下列步骤：(a)用一种重组核酸转化该细胞，该核酸具有乳酸脱氢酶(LDH)基因、LDH基因上游和下游的侧翼序列和至少一个选择性标记基因，该侧翼序列与靶基因上游和下游的侧翼序列同源，使得LDH基因在单交换事件中插入该细胞的基因组内，与靶基因的基因座相邻，(b)选择含有LDH基因和选择性标记基因的第一种转化子，(c)非选择性培养所述第一种转化子，和(d)在所述第一种转化子中选择含有LDH基因但是删除了选择性标记基因和靶基因的第二种转化子。

13.权利要求12的方法，其中所述LDH基因上游的侧翼序列包括与靶基因的启动子序列同源的启动子序列，并且该LDH基因下游的侧翼序列包括靶基因的终止序列。

14.权利要求13的方法，其中所述靶基因是丙酮酸脱氢酶基因。

15.权利要求12的方法，其中所述载体还包含与启动子和终止序列有效连接的标记基因。

16.权利要求15的方法，其中与标记基因有效连接的启动子和终止序列对于该酵母菌株而言不是天然的。

17.马克斯克鲁维酵母种的一种细胞，其具有整合到其基因组内的多个外源乳酸脱氢酶基因，各自处于功能启动子和终止序列的控制之下，其中该马克斯克鲁维酵母细胞的基因组还含有功能丙酮酸脱羧酶基因。

18.权利要求17的细胞，其中所述功能丙酮酸脱羧酶基因对于马克斯克鲁维酵母而言是天然的。

19.权利要求18的细胞，其中所述功能丙酮酸脱羧酶基因是PDC1基因。

20.权利要求19的细胞，其中所述外源乳酸脱氢酶基因来源于瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌。

21.权利要求20的细胞，其含有多个拷贝的来源于瑞士乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。

22.权利要求20的细胞，其含有来源于巨大芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因的多个拷贝。